RNAi技术沉默OPG基因对骨髓间充质干细胞RANKL、OPG表达变化研究

作     者：韦颂观 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：廖红兵

授予年度：2018年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 OPG RNAi RANKL RANKL/OPG 

摘      要：目的:初步探讨通过RNAi技术沉默骨髓间充质干细胞OPG基因来增强破骨细胞活动的可行性,为骨替代材料的降解成骨研究提供新思路。方法:构建慢病毒载体;体外分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs;设立空白对照组(无干预措施的BMSCs)、空载组(空慢病毒载体转染的BMSCs)和OPG沉默组(含OPG基因干扰片段慢病毒载体转染后的BMSCs)。MTT法检测转染后BMSCs的增殖变化;ALP染色法检测OPG沉默后BMSCs的成骨向分化情况。转染后第3、7、14、21天,用RT-PCR检测OPG及RANKL的mRNA表达变化;用Western blot检测OPG及RANKL的蛋白表达变化。各组分别与非黏附性骨髓基质细胞(破骨前体细胞)共培养7天后,用TRAP染色观察破骨细胞生成数量的差异。结果:***结果:3组细胞增殖活力相比较无明显差异(P0.05)。***染色结果:3组细胞均有棕黑色碱性磷酸酶颗粒形成。***-PCR结果:(1)OPG m RNA的表达变化:OPG沉默组的OPG mRNA抑制效果在染后第3天时处于高峰(抑制率达73%),然后逐渐降低,至第21天抑制率降至26%。转染后第3、7、14、21天,OPG沉默组分别为空白组的23%、37%、54%、74%(各时间点两组相比均有显著差异,P0.05。(2)RANKL mRNA的表达变化:OPG沉默组和空载组的RANKL mRNA表达在转染后第3天出现一过性高峰,然后逐渐趋于与空白组同一表达水平。转染后第3、7、14、21天,OPG沉默组分别为空白组的390%、135%、97%、84%(两组在转染后第3、7天相比均有显著差异,P0.05)。转染后第3天空载组与空白组相比有显著差异,P0.05。*** blot结果:(1)OPG蛋白的表达变化:OPG沉默组的OPG蛋白抑制效果在染后第3天时处于高峰(抑制率达69%),然后逐渐降低,至第21天抑制率降至13%。转染后第3、7、14、21天OPG沉默组分别为空白组的31%、45%、68%、87%(转染后第3、7、14天两组相比均有显著差异,P0.05)。各时间点空载组与空白组相比均无显著差异,P0.05。(2)RANKL蛋白的表达变化:转染后第3、7、14、21天,3组之间两两相比较均无显著性差异,P0.05。***/OPG比例变化情况:(1)RANKL/OPG的mRNA比例:OPG沉默组的RANKL/OPG mRNA比例在转染后第3、7、14天分别与空白组相比较均有显著增高(P0.05)。转染后第3天空载组的RANKL/OPG mRNA比例是空白组的2.12倍(两组比较有显著差异,P0.05)。(2)RANKL/OPG的蛋白比例:转染后第3、7、14天OPG沉默组相对空白组分别增高约3.7、2.5、1.44倍(两组间比较均有显著差异,P0.05)。转染后第3、7、14、21天空载组分别与空白组相比均无显著差异(P0.05)。6.共培养结果:OPG沉默组促进破骨细胞生成的数量显著高于空载组和空白组(P0.05)。结论:RNAi技术沉默骨髓间质干细胞OPG基因可通过提高RANKL/OPG比例,为增强破骨细胞活性提供有利条件。