乙型脑炎病毒复制与细胞自噬的相互作用
作者单位：中国人民解放军军事医学科学院
学位级别：硕士
导师姓名：秦鄂德;秦成峰
授予年度：2010年
学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学]
摘 要：细胞自噬(Autophagy)是真核细胞通过溶酶体途径降解胞内自身成份的过程,对维持细胞内环境稳定具有重要作用,同时也是天然免疫的组成部分,在细胞应激包括抗病原体感染等过程中扮演重要角色。然而病原体在长期进化过程中,获得了逃避自噬抗感染作用的能力。有研究表明,某些种类的病毒通过其编码的蛋白抑制细胞自噬的发生,从而逃避自噬的清除作用;而一些正链RNA病毒包括黄病毒属的登革病毒,可利用自噬泡作为复制位点,并通过诱导自噬的发生促进自身增殖。乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)作为嗜神经性的黄病毒属成员,其在感染细胞时能否诱导细胞自噬的发生,细胞自噬在乙型脑炎病毒感染过程中又扮演何种角色均不清楚。因此,揭示乙型脑炎病毒与宿主自噬现象的相互关系可为进一步阐明该病毒的致病机制提供理论依据,并有助于制定乙型脑炎新型的防治策略。 本研究采用自噬活动活跃的肝细胞系,通过免疫印迹和电镜等手段检测乙型脑炎病毒感染前后细胞发生自噬的水平,进一步采用药物处理和基因沉默的方法改变细胞自噬状态,比较不同自噬状态下乙型脑炎病毒复制水平的差异,从而探讨乙型脑炎病毒感染与细胞自噬的相互作用关系。 1.乙型脑炎病毒感染对宿主细胞自噬的影响 为了探讨乙型脑炎病毒感染对细胞自噬现象的影响,我们首先利用透射电子显微镜对病毒感染的肝细胞系HepG2中自噬泡的形成情况进行观察。结果显示,经病毒感染以及用自噬诱导剂处理的HepG2细胞中均可观察到典型的0.5-1μm双层膜的自噬泡结构。然后我们通过免疫印迹的方法检测乙型脑炎病毒感染HepG2细胞中自噬标志蛋白LC3-II/ LC3-I比值的变化,发现病毒感染12h-36h后的细胞内这两种蛋白的比值增加,表明乙型脑炎病毒感染HepG2细胞后可诱导细胞自噬。为了进一步验证该结论,我们用表达GFP-LC3融合蛋白的重组质粒分别转染HepG2细胞及BHK-21细胞,然后再感染乙型脑炎病毒,利用荧光显微镜观察GFP-LC3在细胞内的聚点(puncta)情况。结果显示,病毒感染组发生聚点的细胞比率高于对照组。上述结果表明,乙型脑炎病毒感染不同细胞系包括HepG2细胞和BHK-21细胞均可有效诱导细胞自噬的发生。 2.细胞自噬对乙型脑炎病毒复制的影响 为了探讨宿主细胞自噬对乙型脑炎病毒复制的影响,我们通过人为药物诱导或抑制细胞的自噬,然后感染病毒,利用蚀斑试验测定细胞培养上清中的子代病毒滴度,分析病毒复制水平的变化。我们首先对药物诱导和抑制HepG2细胞自噬的条件进行了优化,最终选用0.1μM雷帕霉素处理细胞6h作为诱导自噬的条件;0.5μM渥曼青霉素处理细胞1h作为抑制自噬的条件。我们观察比较了不同自噬条件下乙型脑炎病毒感染后36h(病毒增殖的对数期)的复制水平,发现与正常细胞相比,自噬抑制条件下乙型脑炎病毒复制水平升高,且复制水平在一定范围内与自噬抑制剂的剂量呈正相关,表明细胞自噬对乙型脑炎病毒复制具有抑制作用。这种抑制作用存在一定的毒株特异性,对疫苗株复制的抑制作用较野生型毒株更为明显。在自噬诱导的条件下,野毒株复制水平无显著变化,而疫苗株复制水平略有增加。自噬诱导剂雷帕霉素对疫苗株感染产生的复制增强作用可能与其参与免疫抑制效应有关,其具体机制有待进一步分析。 3.影响乙型脑炎病毒复制的自噬相关基因 为了进一步探讨细胞自噬抑制乙型脑炎病毒复制的机制,我们对自噬相关蛋白对乙型脑炎病毒复制的影响进行了分析。利用RNA干扰技术对涉及自噬泡形成的关键蛋白LC3及自噬诱导启动蛋白Beclin1的基因进行沉默,感染病毒后通过蚀斑试验测定细胞培养上清中的子代病毒量。结果显示,沉默LC3基因使两株病毒在相应细胞中的复制水平均显著提高,而沉默Beclin1基因后复制水平则无显著差异。这表明LC3的正常表达对于细胞自噬发挥对乙型脑炎病毒的抑制作用具有重要意义;而Beclin1则可能不参与自噬对病毒复制的抑制作用。沉默LC3及Beclin1基因对乙型脑炎病毒复制的影响不同提示我们并非所有的自噬相关因子都参与抗乙型脑炎病毒感染,而不同的自噬相关蛋白可能通过不同的通路发挥抗病毒作用。 本研究结果表明,乙型脑炎病毒感染细胞后能够诱导细胞发生自噬,而细胞自噬可在LC3蛋白的参与下抑制乙型脑炎病毒的增殖。本研究为深入探讨乙型脑炎病毒与宿主细胞相互作用奠定基础,也为乙型脑炎的防治策略提供新思路。
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