K562/ADM细胞耐药性与有氧糖酵解的关系及双氢青蒿素诱导其铁死亡的研究

作     者：艾子莺 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：魏虎来

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：有氧糖酵解 多药耐药 糖酵解抑制剂 AKT/m TOR Mek/MAPK K562 K562/ADM 铁死亡 双氢青蒿素 多药耐药性 枸橼酸铁铵 Ferrostatin-1 

摘      要：有氧糖酵解与K562/ADM细胞耐药性的关系研究背景与目的:多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。有氧糖酵解增强已被列为肿瘤细胞重要的生物学标志。近年研究认为增强的有氧糖酵解与肿瘤恶性程度及临床耐药密切相关,但其发生机制及调控方式并不清楚。本课题以白血病敏感细胞K562和由K562诱导而来的MDR细胞K562/ADM为研究模型,比较研究药物敏感细胞与耐药细胞糖代谢模式的差异,明确耐药细胞不同于亲本敏感细胞的糖代谢特征,探讨K562/ADM细胞多药耐药性与有氧糖酵解的关系,深入分析抑制有氧糖酵解逆转K562/ADM细胞耐药性的可行性及分子机制,以期为临床克服肿瘤细胞耐药提供新的策略。方法:采用MTT法检测细胞的增殖活性;酶学方法检测细胞葡萄糖消耗、乳酸产量、糖代谢相关酶活性及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;生物发光法检测三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP),荧光探针标记法检测细胞内线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;Western-blotting法检测糖代谢相关信号通路中蛋白的表达及活化程度。结果:1.常氧条件下,K562/ADM细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量均明显高于亲本K562细胞(P0.05),但ATP含量无显著性的差异;酶活性相比于K562细胞,K562/ADM细胞己糖激酶(hexokinase,HK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙酮酸激酶(pyruvate,PK)的酶活性显著增高(P0.05-0.001)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)活性降低(P0.01);Western-blotting检测发现K562/ADM细胞葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)和LDH-A表达量高于K562细胞(P0.01-0.001)。比较线粒体功能变化,K562/ADM细胞MMP低于K562细胞,GSH水平升高(P0.01-0.001),但ROS水平两细胞无显著差异。2.糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)的干预会增强K562/ADM细胞和K562细胞对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性,K562细胞增殖抑制率提高了15%,而K562/ADM细胞则提高达30%。2-DG能够降低细胞ATP含量,当2-DG浓度达到4m M时,K562/ADM细胞ATP下降倍数高于K562细胞近1倍。ADM可使白血病细胞内葡萄糖消耗、乳酸输出及己糖激酶活性均受到抑制,联合应用2-DG抑制糖酵解后,K562细胞葡萄糖消耗量的抑制率增加30%,乳酸生成的抑制率增加10%,而K562/ADM细胞则分别达到40%、30%;抑制糖代谢对K562细胞HK活性几乎没有影响,而K562/ADM细胞HK活性则下降了10个单位。此外,2-DG还诱导K562/ADM细胞内ROS含量上升和GSH浓度的降低。3.K562/ADM细胞与K562细胞比较,AKT-m TOR-c Myc和Mek-MAPK信号通路处于高活化状态。糖代谢抑制剂2-DG能够显著抑制K562/ADM细胞AKT-m TOR-c Myc和Mek-MAPK信号通路,2-DG与ADM联合处理,K562/ADM细胞AKT表达量明显下降,而K562细胞没有明显变化;K562/ADM细胞m TOR表达及磷酸化水平降低70%以上,而K562细胞下降则不足30%;K562/ADM细胞c-Myc表达下降14%,K562细胞没有变化;K562/ADM细胞Mek、MAPK表达量及磷酸化水平下降均超过40%,K562细胞几乎不受影响。2-DG抑制K562/ADM细胞糖代谢相关AKT-m TOR-c Myc通路,其下游糖代谢相关蛋白GLUT4、LDH-A、GSK-3β的表达均受到抑制(P0.05-0.01)。结论:1.K562/ADM耐药细胞有氧糖酵解能力显著强于K562敏感细胞,存在HK、PK、LDH活性增高,GLUT4、LDH-A高表达及线粒体供能减弱的代谢重编程现象。2.K562/ADM细胞的耐药性与增强的有氧糖酵解能力密切相关,抑制有氧糖酵解可有效逆转K562/ADM细胞对阿霉素的耐受性。3.2-脱氧葡萄糖逆转K562/ADM细胞耐药性的机制除直接竞争性抑制HK活性、降低糖酵解而减少ATP供应外,还与降低AKT-m TOR-c-Myc通路和Mek-MAPK通路活性、下调代谢效应蛋白GLUT4、LDH-A和GSK-3β表达量,进而降低耐药细胞能