灯盏花R2R3 MYB基因的克隆、转化及转基因植株的叶绿素荧光参数、类黄酮含量分析
作者单位：云南师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：张云峰
授予年度：2017年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种]
摘 要：灯盏花,别名又叫做灯盏细辛或短亭飞蓬,为菊科飞蓬属的一种植物,以灯盏乙素为主的类黄酮化合物为其主要的有效药用化学成分。特殊的生理活性和多元性的生物功能,使得类黄酮这一植物体内的次生代谢产物研究,成为当下诸多学科的研究热点之一。在植物体内,生成类黄酮的通路是以苯丙烷代谢途径为主的类黄酮代谢途径及其衍生的代谢通道。本研究基于前期灯盏花转录组测定的基础上,首先从100多条注释为unigene中筛选了一条与可能与类黄酮代谢相关的R2R3 MYB基因,并利用RACE技术对其全长cDNA序列进行了克隆。其次,以质粒pBI121-eGFP为基本骨架,构建了该基因与eGFP融合的表达载体,并以农杆菌GV3101为介导,将其导入灯盏花体,以实现所克隆MYB基因的超表达。最后对转基因植株的叶绿素荧光及代谢产物进行了测定。实验所得的具体结论如下:从众多的unigene中筛选了一条疑似类黄酮代谢相关的R2R3基因,命名为EbMYB06。在对EbMYB06编码的蛋白质进行理化性质分析,结果表明,蛋白分子质量为63.80KDa,理论等电点为5.18。编码多肽的原子组成为C2377H3976N780O996S129。不稳定系数为35.45,由此说明该蛋白是一个稳定蛋白。脂溶指数(Aliphatic inde)为33.21,总平均亲水性(GRAVY)为0.721,表明该蛋白是一个疏水蛋白。利用ProScale分析和预测蛋白质疏水性,第369位和428位分别为Thr和Pro,疏水性最强,为2.189;第715,717位为Gly,Leu,亲水性最强,为-0.600。利用TMpred分析蛋白质的跨膜性,结果没发现跨膜结构或者膜结合区域。该编码蛋白在1处丝氨酸上,1处苏氨酸以及2处酪氨酸存在潜在磷酸化位点。第30-31位氨基酸之间存在一个潜在的信号肽断裂位点。二级结构分析显示,该蛋白主要是由无规则卷曲(46.15%)和螺旋(43.85%)组成。系统树的构建表明,EbMYB06与拟南芥中的四个转录因子AtMYB4、7、32、6、8离得最近,共同聚为一个组,有着最为接近的进化关系;然后EbMYB06同时又和拟南芥At MYB111、11、12共同构成一个相邻的组,由此推测EbMYB06可能与AtMYB4,7,6,8,32有着相似的功能,和类黄酮的生成有一定关系。对MS培养基中适宜灯盏花生长的激素以及抗生素浓度做了相关实验,发现添加0.3mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA的MS培养基最适合用于灯盏花的预培养,而最终卡那霉素和头孢霉素的选择分别为5mg/L和200mg/L。克隆了EbMYB06并通过农杆菌介导转入灯盏花体内,以实现相关基因的超表达,实验共获得6株转化灯盏花,并在后续实验对其做叶绿素荧光及代谢产物(类黄酮,总酚)分析。发现其总酚与类黄酮含量较野生型灯盏花有明显升高。而对叶绿素荧光参数的分析来看,qP值转基因灯盏花较野生型高,表明转基因灯盏花光系统吸收的能量用于进行光化学反应的比例较野生型高。而转基因灯盏花Fv/Fm值转基因灯盏花较野生型低,Fv/Fm值即光抑制的指标,暗适应下PSⅡ的最大光化学效率,植物在逆境条件下,往往伴随着强光,容易发生光抑制,光抑制时,Fv/Fm值明显下降,推测该值的下降导致了类黄酮含量的升高。同时叶绿素b的含量以及叶绿素a和叶绿素b的比值的测量结果转化后较普通植株高,而叶绿素a与叶绿素b的比值和光合速率呈负相关性,这与类黄酮升高的现象符合。实验表明EBMYB06的导入导致了转基因灯盏花叶绿素b含量的上升,同时增加了类黄酮的生成,至于是通过何种途径增加了类黄酮的生成还需要进一步的研究。
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