白藜芦醇对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

作     者：屈振超 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张劭

授予年度：2015年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：白藜芦醇 动物模型 缺血再灌注损伤 Gadd45a 

摘      要：研究背景和目的肝移植已成为治疗终末期肝脏疾病、急性肝功能衰竭的一种最有效的选择。移植后的肝脏及胆道具有正常生物学功能是评价手术成功的关键。冷、热缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是引发移植术后肝脏无功能的主要原因。而药物预处理可以降低肝脏、胆道移植的缺血再灌注损伤,从而有可能降低肝脏失功的发生。白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种能从葡萄、虎杖、花生、桑椹等多种植物中提取的具有很强生物活性的多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎症、抗血栓形成、抗衰老、免疫调节及抗肿瘤作用,能够预防心血管疾病、肿瘤的发生。目前白藜芦醇主要被用于研究对心、脑、肾等器官的保护作用,而对肝脏,尤其是肝及胆道缺血再灌注损伤保护方面研究较少。本实验拟通过模拟肝移植的热缺血、冷缺血到再灌注复温的全过程,探索建立一种稳定的、操作简单的小鼠肝脏及胆道的冷、热缺血再灌注损伤模型,然后利用该模型,探讨白藜芦醇预处理对肝脏及肝外胆道的缺血再灌注保护作用及其可能的机制,从而为白藜芦醇更安全、合理的应用于临床提供理论依据。方法本实验分为2个时间阶段,第一阶段为肝脏缺血再灌注模型建立与改进的探索阶段,第二阶段为模型成功后,研究白藜芦醇较长周期给药对接受上述缺血再灌注损伤的肝及胆道的保护作用。第一阶段:选取健康、成年、清洁30只KM小鼠,参考并改进赵宏峰[2]的大鼠自体原位肝移植模型,用4℃含12.5U/ml肝素的乳酸林格氏液分别经小鼠肠系膜上静脉、腹主动脉双重恒压恒温灌注,同时从胆囊置管冷冲洗胆道,并利用“支架法吻合血管。观察记录手术时间、手术成功率及冷灌注效果;第二阶段:再次选取健康、成年、清洁KM鼠60只,随机分成三组,每组20只。A组为空白对照组,B组为缺血再灌注(IR)组,C组为白黎芦醇预处理+缺血再灌注(IR)组,C组小鼠于实验开始前完成白藜芦醇的预处理:给予RSV 20 mg/kg溶于100 g/L羟丙基-β-环糊精生理盐水中灌胃0.2ml,连续2周,每日1次,B组给予相同体积的0.9%生理盐水。A组仅行单纯的开关腹手术。灌胃2周后的B、C两组小鼠立即给予上述建立的肝脏及胆道冷热缺血再灌注损伤。术后2小时留取标本。比较各组小鼠的存活率、热缺血时间、无肝期时间,肝功能指标血清ALT水平,肝脏、肝外胆总管病理学形态改变和Western-blot检测Gadd45a的表达。结果(1)缺血再灌注模型探索阶段,实际共行手术50例,其中20例为预实验,主要掌握麻醉剂量、手术技巧及其改进方法。定型术30例,死亡10例,手术成功率66.7%(20/30),热、冷缺血和再灌注时间可精确控制,无肝期控制在20分钟以内。双重灌注加胆道冲洗效果好,病理切片示胆道壁毛细血管未见红细胞。该模型达到模拟肝冷热缺血再灌注损伤要求,具有操作简单、稳定性强、手术时间相对较短、专一性强的特点。(2)白藜芦醇较长周期给药实验阶段,1)A组无伤亡,术中B、C组各死亡5例,B组与C组存活率无统计学差异(P0.05)。2)血清ALT水平:A组术后血清ALT水平处于正常范围内;对比A组,B、C两组各时间点的血清ALT水平都显著升高,但C组低于B组,存在统计学意义(P0.05),提示C组较B组肝功能损害轻。3.肝组织及肝外胆总管HE染色病理观察:A组(对照组):肝细胞的形态大小基本正常,肝窦清晰可见,胆总管管壁完整,上皮细胞无脱落坏死。B组:肝细胞明显水肿,胞浆淡染,有空泡变性,肝血窦变窄几乎消失。胆总管上皮脱落坏死,上皮结构模明显不完整。C组较B组,肝细胞轻度水肿,胞浆深染,无空泡变性,肝血窦变窄,但尚可见,胆总管上皮结构尚完整连续,其病理损伤明显减小。***-blot检测结果:空白对照组Gadd45a的表达为弱阳性;B组缺血再灌注组灰度值比值为0.24士0.07;C组白藜芦醇预处理组Gadd45a灰度值比值为0.79士0.09;结果显示C组较A、B组肝脏Gadd45a表达均明显偏高,均具有统计学意义(P0.01)。提示白藜芦醇可提高缺血再灌注肝脏Gadd45a的早期表达。结论1、白藜芦醇可以降低受冷热缺血再灌注损伤的小鼠肝血清转氨酶的水平,减轻肝及肝外胆管缺血再灌注损伤,对肝脏及肝外胆道具有明显保护作用。2、白藜芦醇可促进缺血再灌注的肝组织Gadd45a的早期表达。