去甲斑蝥素诱导人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株表达免疫激活物激发外周血单个核细胞杀伤活性

作     者：余莉华 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭坤元

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：去甲斑蝥素 Raji细胞 细胞集落 细胞周期 杀伤IL-2 IL-15 NKG2D 

摘      要：[研究背景] Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)是一种高侵袭性,快速生长的成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤,是增殖扩散能力最强的人类肿瘤之一。目前常用的治疗方案常有放化疗、手术治疗、单克隆抗体CD20、骨髓移植治疗等方法。由于其对化疗敏感,儿童及耐受能力强的成人患者主要采用短疗程强烈化疗,但化疗毒副作用大,年老体弱、合并HIV患者难以耐受高强度化疗,难以从大剂量化疗中获益。因此,寻找一种新的药物或者新的治疗手段,既能特异杀灭肿瘤细胞,同时提高肿瘤细胞被机体免疫系统识别杀伤的敏感性,并能对机体的影响减到最小,将是研究的方向。 去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)是斑蝥素去甲基化人工合成的衍生物,具有跟斑蝥素类似的药用价值,包括抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化等,但NCTD减弱了斑蝥素的强烈毒性和消除了其对泌尿系统的刺激性,保留了其抗癌和升高白细胞等的作用,是天然的丝／苏氨酸磷酸酶PP1及PP2A抑制剂。目前研究显示NCTD能抑制多种肿瘤细胞株的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡和产生细胞周期阻滞作用。 NCTD在体内抑制肿瘤细胞的同时,不降低外周血中的白细胞数量,而且对机体没有明显的骨髓抑制作用,使得其在对抗恶性肿瘤中,体现了特有的优势。但有关NCTD对Burkitt淋巴瘤Raji细胞株的作用尚未见相关报导,因此,我们拟探讨NCTD对Raji细胞株生物学特性的影响,为研究NCTD对抗恶性侵袭性淋巴瘤提供实验室基础。 目前单纯细胞治疗在大多数肿瘤患者中未取得如体外实验般高的杀伤效应,其主要原因有肿瘤细胞逃避免疫细胞杀伤,体内产生免疫耐受,肿瘤细胞与免疫杀伤细胞之前存在免疫编辑,使免疫杀伤细胞丧失本来应有的功能。有研究进一步发现Burkitt淋巴瘤Raji细胞株能抵抗同种异体NK (natural kill,NK)细胞的杀伤,原因主要是肿瘤细胞表面高表达HLA-I类分子,极低表免疫激活物(immunoactivators) NKG2D配体MICA/B和ULBP1-3有关。这些配体在正常的细胞不表达或低表达,可应激性表达在一些肿瘤细胞或病原体感染的细胞的表面。活化性受体NKG2D与其配体结合产生的信号可直接激活NK细胞发生抗肿瘤效应,并作为协同刺激信号促进α β T细胞和γ δ T细胞的活化并增强其杀伤效应。因此,可通过增强NKG2D及其配体的相互作用,促使肿瘤细胞被杀伤。不同的细胞因子能促进NK细胞增殖,提高活化性受体NKG2D的表达,而NCTD是否能诱导Raji细胞增表达免疫激活物,激发机体免疫细胞对其的杀伤呢?将是本实验研究的重点。 本实验从NCTD对Raji细胞株生物学特性的影响以及NCTD是否能调节Raji细胞被免疫杀伤细胞杀伤的敏感性及其初步机制探讨这2个方面进行研究,从而为NCTD对抗恶性侵袭性Burkitt淋巴瘤提供体外实验研究,了解NCTD是否能增强Raji细胞被杀伤的活性,从而探究提高过继细胞免疫治疗疗效的方法,为新的免疫治疗方案提供新的思路。 第一部分去甲斑蝥素对Burkitt淋巴瘤Raji细胞株生物学特性的影响 [目的]对比研究NCTD对Raji细胞和人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的增殖抑制作用,探讨NCTD对Raji细胞的集落形成能力以及细胞周期的影响。 [方法]通过台盼蓝拒染法观察不同浓度的NCTD (0.15265、0.3125、0.625、1.25、2.5ug/ml)对Raji细胞及PBMC的增殖抑制情况;甲基纤维素半固体培养基集落形成法观察的NCTD (0.***.25.0.5、lug/ml)预处理48小时组和直接作用组对Raji细胞集落形成能力和自我更新能力的影;流响式细胞仪(Flow cytometry, FCM)检测NCTD (0.5ug/ml)作用48小时后对Raji细胞周期变化的影响。 应用SPSS13.0软件进行数据分析,本实验数据资料以均数±标准差(x±s)表示,NCTD对Raji细胞及PBMC的增殖抑制实验和体外集落克隆形成实验使用析因设计资料的方差分析。NCTD对Raji细胞的细胞周期影响采用独立样本t检验,P0.05认为差异有统计学意义。 [结果]在浓度为0.15-2.5ug/ml范围内NCTD抑制Raji细胞增殖,具有剂量时间依赖性,其24小时、48小时、72小时的IC50值分别为：0.88ug/ml0.47ug/ml、0.28ug/ml在24h各浓度下Raji细胞与PBMC比较差异具有统计学意义(F=1005.664,P=0.000)。且各浓度NCTD对PBMC既无增殖亦无毒性作用,各浓度间比较差异无统计学意义(F=0.866,P=0.517)。NCTD (0、0.25、0.5、 l