八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究

作     者：丰九英 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨斌盛

授予年度：2003年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：中心蛋白 基因表达 基因重组 八肋游仆虫 光谱性质 

摘      要：中心蛋白(Centrins)是真核细胞中一种重要的蛋白质，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。目前，中心蛋白结构与功能的研究依然是细胞生物学研究的热点之一，但国内外关于Centrins的研究多集中在生物功能上，仍没有晶体结构的报道，从溶液结构入手进行结构与功能关系的探讨也很少。近年来稀土资源的不断开发利用增加了稀土元素进入生命体的途径和机会，这使得稀土元素在生命体中的代谢模式受到普遍重视。Centrins是钙结合蛋白家族的成员，含有四个EF-hand结构域，每个结构域可能结合一个Ca，所以它可能是稀土离子在生物体内实现其生物效应的载体。 目前国内外尚无关于单细胞低等真核生物-游仆虫中心蛋白基因表达、溶液构象和生物功能等方面的研究报道。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术构建了八肋游仆虫中心蛋白基因centrin的重组表达质粒pGEX-6p-1-centrin，并将其转入大肠杆菌(***)BL21中用IPTG诱导，获得centrin的可溶性融合表达。融合蛋白GST-Centrin菌体裂解液上清经GST亲和层析后用PreScission Protease(PPase)酶切，酶切产物再经GST亲和层析和Hitrap Q阴离子交换层析两步柱层析纯化后，得到纯度较好(90％以上)的Centrin。 纯化后的Centrin先运用GenePro对它的一些参数及性质做了预测，诸如等电点、净电荷量、亲水亲脂性、α-螺旋分布及钙结合区氨基酸序列分布等，以期为后续实验研究起到理论性的指导作用。预测分析表明：中心蛋白是一个酸性(pI 6.5)、小分子量(19664Da)、水溶性(Hydrophobic 26.2％)蛋白，它含有四个EF-hand型结构域，每个结构域可能结合一个钙离子，但N-端区和C-端区的钙结合能力可能有差别。 然后通过紫外光谱和荧光光谱的方法探讨了它与金属离子(Ca、Tb)及小肽(Melittin)的相互作用。实验结果表明：Ca、Tb与apoCentrin结合时在蛋白上的作用位点为同一位点，而且键合顺序也相同，即均优先占据蛋白C-端区的第Ⅲ和第Ⅳ位：在与金属离子结合时蛋白四个钙结合位点中的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)残基侧链参与了金属离子的配位：Tb能竞争Ca的结合位点，并且能完全占据钙结合位点，Ca的存在并不影响Tb在Centrin上的结合顺序;Melittin与Centrin的相互作用后形成1:1的复合物，它们之间的相互作用不依赖于Ca，两者结合后Centrin的溶液结构可能由原来的哑铃形变为球形;Tb与apoCentrin的结合并不影响蛋白与Melittin相互作用，但Melittin与apoCentrin相互作用导致Tb不能与蛋白结合：Melittin与Centrin作用时，Ca的存在使得Tb能与Centrin结合但不能完全占据它的四个结合位点。