幽门螺杆菌cagT基因的克隆表达及重组蛋白对诱导SGC-7901细胞炎症因子表达和细胞增殖的影响

作     者：崔蕾蕾 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵世和

授予年度：2008年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：幽门螺杆菌 cagT 克隆 表达 细胞因子 增殖 

摘      要：目的:探讨cagT基因在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)cag致病岛(cag pathogenicity island,cag PAI)编码的Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system,TFSS)装置中的作用;并通过与胃癌细胞相互作用,研究其重组蛋白对胃癌细胞分泌炎症因子的能力和增殖的影响,为进一步阐明***的致病机制奠定基础。 方法:根据GenBank收录的*** 22695全基因组序列,利用生物学软件Primer Premier5.0设计扩增cagT基因的引物,并引入限制性核酸内切酶酶切位点;应用PCR技术从*** NCTC 11637基因组DNA中扩增cagT编码基因片段后,克隆至pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(Escherichia coli,***)DH5α,双酶切鉴定筛选阳性克隆,进行序列测定。应用生物信息学技术,对cagT基因编码的氨基酸序列与已知的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,***)TFSS结构基因virB7进行同源性比对,并对其编码的蛋白质做理化特性的预测分析。再将其定向插入原核表达载体pQE30中,转化至表达宿主菌*** M15,通过氨苄青霉素抗性筛选和双酶切鉴定阳性克隆。IPTG诱导其表达,表达的蛋白经Western blot鉴定,并以Ni-NTA树脂进行纯化。纯化后的重组蛋白免疫家兔,制备抗CagT多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测血清抗体效价。重组蛋白与SGC-7901细胞作用一定时间,提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测IL-8 mRNA的表达;并用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)法检测蛋白对细胞增殖的影响。 结果: *** NCTC 11637 cagT基因全长843bp(GenBank登录号为EF114758),编码280个氨基酸,与***其它菌株基因序列的核苷酸同源性为96%～99%;与***的VirB7具有同源性;DNAStar软件预测其编码的蛋白质的相对分子量为32.33kDa,具有较强的免疫原性。 2.成功构建pQE30-cagT原核表达重组质粒,确定IPTG终浓度0.8mmol/L,温度30℃,诱导时间4h为最佳诱导条件,Western blot检测结果显示该重组蛋白可与抗His标签抗体结合反应,经Ni-NTA纯化后可获得纯度约为98%的CagT重组蛋白,相对分子质量(Mr)约为32kDa,与预测结果一致。CagT重组蛋白免疫家兔,获得抗CagT多克隆抗体,其效价为1:1.6×10。 3.终浓度10μg/mL的CagT重组蛋白作用于SGC-7901细胞4h后,可扩增出IL-8片段。 4.不同浓度的CagT重组蛋白与SGC-7901细胞作用6、24及48h后,细胞增殖的程度随着CagT重组蛋白浓度的增加和作用时间的延长而逐渐降低。 结论: 1.成功克隆了cagT基因,其与已知的***的TFSS结构基因virB7具有同源性,是*** cag PAI编码的TFSS的结构基因之一。 2.成功构建了原核表达载体,获得了CagT重组蛋白,并制备了兔源性抗CagT多克隆抗体。 ***重组蛋白可诱导SGC-7901细胞表达IL-8 mRNA。 ***重组蛋白对SGC-7901细胞的增殖有一定抑制作用,其抑制作用随着蛋白浓度增加和作用时间延长而逐渐增强。