MGFE肽预处理对骨修复中MSCs对流体剪切力和低氧损伤耐受的影响

作     者：郝晓英 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕永钢

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 力生长因子E肽 流体剪切力 低氧 活性 增殖 骨组织工程 

摘      要：骨损伤，尤其是大段骨缺损较为常见。除运动损伤外，创伤、肿瘤以及感染也会造成骨组织部分或全部损伤，进而导致生理功能缺失，严重影响人们正常生活，威胁人类健康。骨组织工程是目前治疗大段骨缺损最有效的途径，骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)作为骨组织工程理想的种子细胞，在体外进行大规模扩增或移植入体内时，过载流体剪切力和低氧微环境均会对细胞造成一定程度的损伤。为了提高MSCs对流体剪切力和低氧损伤的耐受能力，本文假设力生长因子(Mechano Growth Factor, MGF) E肽预处理可降低流体剪切力和低氧对MSCs造成的损伤。本研究以Sprague Dawley (SD)大鼠MSCs为种子细胞来源，采用平行平板流动腔装置施加流体剪切力刺激，选用化合物氯化钴(CoCl2)模拟低氧微环境，考察了MGF E肽预处理24h后，MSCs对流体剪切力(30min)刺激和低氧(24h)微环境耐受的影响，重点考察了MSCs活性与增殖能力的变化情况。主要研究内容和实验结果如下： ①MGF E肽预处理对MSCs剪切力(72dyn/cm2)损伤耐受的影响 1)三个不同大小流体剪切力刺激对MSCs活性的影响。结果显示，与对照组相比，8dyn/cm2对MSCs的活性没有显著影响。24dyn/cm2(体内生理水平范围)使MSCs的活性显著提高了55.29%。当流体剪切力增大至72dyn/cm2时，MSCs的活性降低了54.47%。 2)在72dyn/cm2刺激下，MGF E肽预处理对MSCs活性的影响。结果显示，在72dyn/cm2刺激下，与0ng/ml相比，25、50和100ng/ml MGF E肽预处理使MSCs的活性分别提高了98.07%、155.07%和68.66%。且50ng/ml比25和100ng/ml MGF E肽预处理效果更显著，使该细胞活性恢复至正常(未使用MGF E肽预处理，也未接受流体剪切力刺激)。 3)50ng/ml MGF E肽预处理的长期效果。72dyn/cm2刺激下，在同一时间点(24、48和96h)，与0ng/ml相比，50ng/ml MGF E肽预处理使MSCs的活性分别提高了155.07%、34.33%和34.83%，继续培养24h效果最明显。 4)72dyn/cm2流体剪切力和50ng/ml MGF E肽预处理对MSCs增殖能力的影响。EdU染色结果显示：与对照组相比，损伤组中EdU标记的新生成细胞数目显著减少，MSCs的增殖率由对照组8.80±0.06%降低至5.12±0.02%(p0.05)。与损伤组相比，50ng/ml MGF E肽预处理使EdU标记的新生成细胞数目明显增多，继续培养24、48和96h后，细胞的增殖率由5.12±0.02%提高至7.06±0.15%、10.19±0.52%和12.51±0.7%(p0.05)。预处理组中，继续培养48h后，MSCs的增殖能力已恢复正常。 5)在生理条件下MGF E肽预处理对MSCs活性的影响。静态培养环境中，2500ng/ml MGF E肽预处理对MSCs的活性没有影响。25和50ng/ml MGF E肽预处理后，与静态培养组相比，8dyn/cm2使MSCs的活性分别提高了62.21%和80.69%。 6)与静态培养组相比，在24dyn/cm2刺激下，未使用和使用50ng/ml MGF E肽预处理使MSCs的活性分别提高了55.29%和105.12%。表明流体剪切力和MGF E肽预处理对MSCs的活性具有协同作用。 ②MGF E肽预处理对MSCs低氧(CoCl2：500μmol/l)损伤耐受的影响 1) MSCs分别与不同浓度CoCl2共同孵育24h后，该细胞的活性情况。与对照组相比，100和200μmol/l CoCl2使MSCs的活性分别提高12.31%和11.97%。而500、1000和2000μmol/l CoCl2使MSCs的活性分别下降了31.59%、46.35%和72.98%。 2)在500μmol/l CoCl2作用下，MGF E肽预处理对MSCs活性的影响。在500μmol/l CoCl2作用下，与0ng/ml相比，5、10、25、50、100ng/ml MGF E肽预处理使MSCs的活性分别提高了37.28%、54.26%、47.38%、39.86%和41.50%。并且均使该细胞活性水平恢复至正常。 3)5ng/ml MGF E肽预处理的长期效果。500μmol/l CoCl2刺激下，在同一时间点(0、24、48和96h)，与0ng/ml相比，5ng/ml MGF E肽预处理使其细胞活性分别提高了37.28%、33.01%、82.85%和43.11%，继续培养48h效果最显著。 4)500μmol