全细胞催化阿糖胞苷区域选择性酰化反应的研究
作者单位：华南理工大学
学位级别：硕士
导师姓名：吴晖
授予年度：2011年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学]
摘 要：阿糖胞苷(ara-C)是一种具有较高药理活性的非天然核苷,临床上可用来治疗白血病。但其在反应中存在脂溶性差、在血浆中半衰期短等缺点。利用阿糖胞苷的酰化反应可获得其单酰类衍生物,此类衍生物已被证明较之原药具有更高的抗肿瘤活性。此外,阿糖胞苷的酰化反应也是核苷化学中重要的基团保护反应之一。目前阿糖胞苷的酰化主要采用化学法和酶法。尽管酶法制备一方面克服了化学法区域选择性差,反应步骤复杂,环境不友好等弊端,但也存在稳定性差,成本高的缺陷。基于以上情况,本论文首次探讨了利用微生物全细胞促阿糖胞苷区域选择性酰化反应的可行性;对比研究了不同来源菌株及不同碳源诱导下的全细胞脂肪酶催化阿糖胞苷区域选择性酰化反应的特性;探讨了有机溶剂种类及反应条件对全细胞促阿糖胞苷区域选择性酰化反应的影响规律;在此基础上,建立其可用于催化阿糖胞苷酯合成反应的全细胞催化体系。 在所研究的不同来源微生物菌株中,米曲霉Aspergillus oryzae 3.5232和GIM3.30显示了较高的催化阿糖胞苷酰化反应的活性,其中Aspergillus oryzae 3.5232催化该反应的反应初速度和底物转化率最高,分别达3.03 mmol/L和65.54%;两株米曲霉均对阿糖胞苷的3′-羟基位点显示了相对较高的选择性。 向含有酵母膏的基础培养基中加入油脂类诱导剂作为补充碳源,所培养的A.oryzae菌体细胞在催化阿糖胞苷酰化反应中的催化活性均较未添加时不同程度提高。其中Tween 85和Tween 80的诱导效果明显优于Span 80、橄榄油及油酸。此类诱导剂水解产生脂肪酸的饱和度、链的长度以及脂肪酸的浓度,均是影响脂肪酶产量和其酰化活性高低的关键因素。而添加常规碳源葡萄糖和麦芽糖后培养的菌体细胞未检测到其催化该酰化反应的活性,推测此类速效碳源的加入对相关脂肪酶的合成具有阻遏作用。添加Span系列后,所培养细胞催化阿糖胞苷酯化反应产生3’-乙酯产率均高于含Tween系列表面活性剂培养基中培养细胞,其中添加Span80所培养细胞的3’-区域选择性达73.3%, 在含酵母膏的基础培养基中添加不同种类的碳源均能不同程度地增加米曲霉A.oryzae菌体的生物量。其中以葡萄糖和麦芽糖两种速效碳源对生物量增加的效果最佳;不同种类的补充碳源对A.oryzae菌体生长的促进作用与所培养细胞的催化特性之间不存在一致关系。 油脂类表面活性剂的浓度对A.oryzae菌体生长和细胞催化特性均有显著影响。添加Tween 80所培养细胞催化核苷酰化反应得最高转化率的诱导剂浓度为0.5g/l,相应反应的底物转化率为61.5%;获得最高3’-区域选择性的诱导剂浓度为1.0%,此时3’-区域选择性为77.13%。使用Tween 85为诱导剂时,所培养细胞催化核苷酰化反应的最佳浓度为0.5g/l,此时底物转化率和3’-位点选择性分别为76.41%和58.26%;使用Span80为诱导剂时,所培养细胞催化核苷酰化反应得最高转化率的最佳诱导剂浓度为0.2g/l,此时细胞3’-区域选择性为81.73%。添加油脂类表面活性剂后培养时间对A.oryzae菌体生长和细胞催化特性有显著影响。使用Tween80为诱导剂,最佳培养时间为72h;使用Tween 85作为诱导剂时,A.oryzae全细胞酶的最大活性出现在稳定期(36h),其催化ara-C的转化率达到76.4%;在含0.2g/l Span80培养基中经48h培养后,A.oryzae全细胞酶催化阿糖胞苷酰化反应的转化率达到最大值(17.0%)。全细胞脂肪酶催化ara-C的3′-位点区域选择性随着培养时间的延长略有增加(72%-82%)。 有机溶剂的种类对米曲霉A.oryzae全细胞促阿糖胞苷区域选择性酰化反应的初速度、底物转化率以及3′-区域选择性有着显著影响。在纯吡啶溶剂中,A.oryzae催化该反应24h的底物转化率为26.7% ,3′-区域选择性为67.4%。在极性有机溶剂吡啶中添加部分疏水性有机溶剂所组成的混合溶剂,既可以较好地溶解底物阿糖胞苷又有利于保持全细胞酶的活性。其中在25%(v/v)己烷-吡啶混合有机溶剂体系中,A.oryzae催化该反应的底物转化率达到70.5%,3′-区域选择性为62.1%。在混合溶剂极性与底物转化率之间表现出了一定的相关性,随着溶剂ET(30)值的降低,米曲霉全细胞催化反应的底物转化率也逐渐增加。反应条件对A.oryzae全细胞促阿糖胞苷区域选择性酰化反应亦有较大影响,体系中最佳水分含量为2.0%,最适温度为25℃,振荡速度以180r/min为宜。 本研究拓宽了全细胞酶非水相催化的应用范围,丰富了核苷有机合成及全细胞生物催化的相关理论体系;为有机合成中的基团保护反应研究及具有药理活性的酯类化合物的绿色合成提供新的理论基础和技术支撑,具有良好的应用前景。
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