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明胶乙酰化修饰工艺及其对中药软胶囊囊壳的性能影响

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中草药 2022年第11期53卷 3314-3320页

作者：王姣陈艳刘像龙张雪桃何小雨余英华王雨琪史亚军赵鹏贾晓斌李瑾陕西中医药大学药学院陕西中药基础与新药研究重点实验室陕西西安712046 中国药科大学中药学院江苏南京211198

目的为了改善中药软胶囊保质期内的崩解迟缓现象,对囊壳材料明胶进行改性优化及性能评估。方法以乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)为酰化剂对明胶进行酰化改性,以复配明胶制备胶皮,并以崩解时限为评价指标比较酰化明胶胶皮与纯明胶胶皮的性能、... 详细信息

目的为了改善中药软胶囊保质期内的崩解迟缓现象,对囊壳材料明胶进行改性优化及性能评估。方法以乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)为酰化剂对明胶进行酰化改性,以复配明胶制备胶皮,并以崩解时限为评价指标比较酰化明胶胶皮与纯明胶胶皮的性能、复配明胶胶皮和纯酰化明胶胶皮的性能;在单因素实验基础之上,以酰化取代度作为评价指标,采用响应曲面法对工艺进行优化。利用红外光谱(infrared spectrum,IR)和扫描电子显微镜(SEM)分析酰化明胶的结构特征;并分析了胶皮的力学性能。结果IR和SEM结果表明,分子侧链上的氨基与EDTAD发生了乙酰化反应,当mEDTAD/m明胶=1∶15、温度为43℃、pH为9.3时,其取代度为65.4%。采用复配明胶制备胶皮,当m明胶/m酰化明胶=10∶1时,崩解时限为18.36 min,机械性能良好。结论通过优化得到的酰化胶皮较好的改善了软胶囊囊壳的崩解迟缓现象。

关键词：明胶酰化崩解迟缓胶皮软胶囊囊壳

糖基化-酰化修饰改善菜籽蛋白凝胶结构和功能性质

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中国油脂 2022年第3期47卷 47-53,93页

作者：何荣黄家强张倩玉南京财经大学食品科学与工程学院南京210023

以菜籽分离蛋白为原料,在琥珀酸酐酰化改性的基础上采用3种多糖(羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖、羧甲基纤维素)协同TG酶催化对菜籽蛋白进行了糖基化修饰,再通过热诱导制备改性菜籽蛋白凝胶,研究不同多糖与酰化协同修饰对菜籽蛋白凝胶结构和... 详细信息

以菜籽分离蛋白为原料,在琥珀酸酐酰化改性的基础上采用3种多糖(羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖、羧甲基纤维素)协同TG酶催化对菜籽蛋白进行了糖基化修饰,再通过热诱导制备改性菜籽蛋白凝胶,研究不同多糖与酰化协同修饰对菜籽蛋白凝胶结构和功能性质的影响。结果表明:糖基化-酰化修饰菜籽蛋白,形成了致密且均匀的凝胶网络结构,使其溶胀性能、流变性能和凝胶强度均得到了改善。其中,羧甲基壳聚糖协同琥珀酸酐酰化修饰菜籽蛋白,获得的菜籽蛋白凝胶硬度最大,为92.337 g,弹性较好,为0.960,溶胀率为8.432 g/g;其表面疏水性最高,为1 305.1,自由巯基含量最低,为1.73μmol/g;其内部形成的网络结构整齐,呈规则且密集的圆形。糖基化-酰化修饰后,菜籽蛋白功能性质的改变可能与其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量均有不同程度的变化有关。

关键词：菜籽分离蛋白凝胶糖基化酰化修饰

酰化乙二醇壳聚糖温敏水凝胶的制备及其性能研究

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酰化乙二醇壳聚糖温敏水凝胶的制备及其性能研究

作者：韩晓杰天津科技大学

学位级别：硕士

水凝胶是由高分子经化学或物理作用交联形成的三维网络结构,并通过与水分子之间的相互作用而吸水溶胀但不溶解。水凝胶具有优良的物理化学特性,如隔热、高比表面积、透气性以及可设计的机械和光学性能,可应用于药物输送及组织工程等生... 详细信息

水凝胶是由高分子经化学或物理作用交联形成的三维网络结构,并通过与水分子之间的相互作用而吸水溶胀但不溶解。水凝胶具有优良的物理化学特性,如隔热、高比表面积、透气性以及可设计的机械和光学性能,可应用于药物输送及组织工程等生物医用领域。水凝胶的合成材料包括天然聚合物和合成聚合物,其中天然多糖具有生物相容性和生物可降解率,广泛应用于生物医学领域。壳聚糖作为一种含有大量游离氨基的多糖,通过对壳聚糖链上的官能团进行修饰,合成多种壳聚糖衍生物。乙二醇壳聚糖(GC)是一种水溶性壳聚糖衍生物,在药物载体及组织工程领域得到了研究人员的关注。本文选择水溶性乙二醇壳聚糖(GC)作为基体,通过改变乙酸酐与GC氨基的进料比,在温和条件下成功合成了乙酰度(DA)为27.55%～86.42%的乙酰化乙二醇壳聚糖(AC-GC)。通过在GC骨架上引入疏水性乙酰基团,提高GC在有机溶剂中的溶解度和体外生物降解性,而且还引入了自组装和温敏性溶胶-凝胶转变性质,这些特性使得AC-GC可用于可注射药物递送系统。AC-GC在溶液体系中可自组装成直径为187.9nm,具有单峰尺寸分布的纳米颗粒。此外,溶解在PBS中的AC-GC(7 wt%)在37℃下表现出温敏性溶胶-凝胶转变。结果表明具有温敏性溶胶-凝胶转变性质的AC-GC有望作为更通用的功能材料应用于生物医学领域。为了扩大GC在药物递送系统中的应用,通过庚酸酐与GC分子链上的氨基进行酰化反应实现改性,合成了具有不同庚酰度(DS)的庚酰化乙二醇壳聚糖(HAGC),制备了物理交联的温敏性HAGC水凝胶。HAGC水凝胶能够响应环境温度变化而发生溶胶-凝胶相变,溶于PBS的HAGC(3 wt%)在37℃表现出溶胶-凝胶相变行为,相较于AC-GC其优势在于成胶浓度更低,且通过改变HAGC的庚酰度和溶液浓度能够有效调节HAGC水凝胶的溶胶-凝胶转变温度。HAGC水凝胶具有三维多孔结构,随着庚酰度增加,HAGC水凝胶的交联密度增大、溶胀比降低、药物释放速率减慢。HAGC水凝胶对吉西他滨具有缓释作用,药物释放时间可达5天,药物释放率在70%～91%之间。HAGC水凝胶以其优良的温敏性能和生物可降解性能,在药物注射载体领域具有重要的应用价值。

关键词：乙二醇壳聚糖酰化溶胶-凝胶转变自组装温敏性水凝胶

酶法合成单酰化表没食子儿茶素没食子酸酯及其抗氧化性能研究

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酶法合成单酰化表没食子儿茶素没食子酸酯及其抗氧化性能研究

作者：姚怡心华南理工大学

学位级别：硕士

脂类中的不饱和脂肪酸易氧化,影响其品质及营养价值,常通过添加抗氧化剂来抑制脂质氧化。天然抗氧化剂由于其安全、高效等特点备受关注。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶多酚的主要成分,是一种较强的天然... 详细信息

脂类中的不饱和脂肪酸易氧化,影响其品质及营养价值,常通过添加抗氧化剂来抑制脂质氧化。天然抗氧化剂由于其安全、高效等特点备受关注。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶多酚的主要成分,是一种较强的天然抗氧化剂。但由于EGCG的Log P值为0.639,具有较明显的亲水性,不适宜直接作为脂类产品的抗氧化剂。然而,研究表明对EGCG进行酰化能够提高其在脂溶性系统的抗氧化性能。但大量研究使用商品化脂肪酶,价格昂贵、转化率较低。并且大多是针对不同酰化度的EGCG衍生物的混合物来研究其抗氧化活性。因此,寻求一种新型酶制剂催化合成单一酰化度的EGCG衍生物,并探究不同链长衍生物在脂溶性系统中的抗氧化活性具有重要意义。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)EGCG衍生物的酶法合成研究。以EGCG和脂肪酸乙烯酯为底物,探究脂肪酶种类、溶剂体系、反应温度、底物摩尔比、加酶量等因素对催化效果的影响。与固定化脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TLIM对比发现,Lipase UM1具有明显优势,其底物转化率和单酰化产物产量均显著高于其他商品化脂肪酶。最佳催化条件为:乙腈为溶剂,反应温度为65℃,底物摩尔比为1:20(EGCG:酰基供体),加酶量为0.3 U/mg EGCG的条件下,反应24 h,底物转化率达到52.6%。并催化合成了不同碳链长度的单酰化EGCG,其中短链酰基供体具有较高的底物转化率。(2)EGCG衍生物的分离纯化与结构鉴定。通过制备型高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)对样品进行分离。经超高效液相色谱质谱联用仪(Ultra Performance Liquid Chromatography-mass spectrometer,UPLC-MS)测定,检测到单酰化产物(碳链长度从C2-C14)的准分子离子峰,分别为m/z 499.0739、m/z527.1063、m/z 555.1382、m/z 583.1710、m/z 611.2083、m/z 639.2422和m/z 667.2813。通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)表征,得知羰基和羟基的化学环境发生改变,并且引入了饱和烷基结构(酰基供体),化合物结构进一步通过核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)确定。经NMR表征,确定了产物的酰化位点,其中碳链长度为C2、C4、C8、C10和C12的单酰化EGCG其酰化位点均在C-4’位上,碳链长度为C6和C14的单酰化EGCG其酰化位点在C-3’和C-4’位上,为两种同分异构体的混合物。(3)不同碳链长度的单酰化EGCG的抗氧化效果评价。EGCG衍生化后其自由基清除能力有所下降,但在亲脂性系统中的抗氧化能力显著提升。通过加速储藏实验、Rancimat试验、高温氧化实验评价不同碳链长度的单酰化EGCG在核桃二酯油中的抗氧化效果。对于不同碳链长度的单酰化EGCG,辛酸EGCG单酯(Octanoic acid EGCG monoester,C8-EGCG)能更好延缓核桃二酯油在加速储藏时过氧化值和茴香胺值的增长,Rancimat试验中具有最高的保护系数(3.47),在高温氧化时能更有效抑制4-羟基-2-壬烯醛(4-Hydroxy-2-Nonenal,HNE)的产生,具有替代人工合成抗氧化剂特丁基对苯二酚(Tert-butylhydroquinone,TBHQ)的潜力。

关键词： EGCG 酶催化酰化结构鉴定抗氧化剂

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氮杂环卡宾催化芳环的自由基酰化反应研究

氮杂环卡宾催化芳环的自由基酰化反应研究

作者：邹文林成都大学

学位级别：硕士

酰基作为一类常见的结构片段在数量众多的天然产物、药物以及合成化合物中,其与芳环结合后形成的酮类化合物在农用化学品、医药、香料、染料、电子元件等有机功能分子当中比比皆是。目前,对于芳环上酰基片段的引入主要依靠传统的Friedel... 详细信息

酰基作为一类常见的结构片段在数量众多的天然产物、药物以及合成化合物中,其与芳环结合后形成的酮类化合物在农用化学品、医药、香料、染料、电子元件等有机功能分子当中比比皆是。目前,对于芳环上酰基片段的引入主要依靠传统的Friedel-Crafts酰基化反应、Minisci反应以及近年来逐渐发展起来的C-H官能团化反应,但是这些反应都存在各自的局限性,在实际应用中往往存在限制。因此,设计合成一种稳定易得的酰基化试剂,并通过此类试剂发展一种高效地构建芳香酮类化合物的策略具有重要的现实意义。自由基化学可以作为一种高效的合成手段用于一些惰性键的官能团转化,其优异的活性,受到越来越多化学家的青睐,其中,氮杂环卡宾（N-heterocyclic carbene,NHC）介导的自由基化学也迎来了蓬勃发展的时期,该类反应与光催化、电催化和金属催化的自由基历程相比,一般具有高反应活性,条件温和,绿色环保等优点。基于上述背景,我们设计合成了一系列氨基甲酸酯和酰胺类底物,其有望在NHC活化下的醛类衍生物形成的Breslow中间体通过单电子转移过程产生氮自由基,随后氮自由基被芳环捕获异构化形成环己二烯自由基,与反应体系中的酰基自由基中间体发生偶联,高效地构建芳香酮类化合物。在前期工作基础上,我们利用合成的氨基甲酸酯和酰胺类底物,实现了苯环对位的酰基化,构建了一系列芳香酮类化合物。通过对产物的衍生化研究,进一步丰富了产物的有用性。同时,与前期报道的大部分文献中对苯环的间位或者邻位进行酰基化相比,该反应能够区域专一性的对苯环的对位进行酰基化,为芳环的专一性官能化提供了重要的参考。

关键词：酰化芳环氮杂环卡宾自由基

N-叔丁基亚磺酰基亚胺酯α-位立体选择性酰化反应的研究

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N-叔丁基亚磺酰基亚胺酯α-位立体选择性酰化反应的研究

作者：张赟云南大学

学位级别：硕士

通过手性N-叔丁基亚磺酰基亚胺与亲核试剂反应制备手性胺,在有机合成中的应用已经很广泛。另外,对于含有α-H的这类亚胺化合物也可以与亲电试剂反应,构建C-X键(X=C,N,O,S,F)。基于N-叔丁基亚磺酰基优秀的手性诱导能力,本论文利用手性N-... 详细信息

通过手性N-叔丁基亚磺酰基亚胺与亲核试剂反应制备手性胺,在有机合成中的应用已经很广泛。另外,对于含有α-H的这类亚胺化合物也可以与亲电试剂反应,构建C-X键(X=C,N,O,S,F)。基于N-叔丁基亚磺酰基优秀的手性诱导能力,本论文利用手性N-叔丁基亚磺酰基亚胺酸酯与酰化试剂反应,实现N-叔丁基亚磺酰亚胺酯的立体选择性酰化,制备含有α-手性中心的β-羰基亚胺酸酯类化合物。N-叔丁基亚磺酰基亚胺酸酯在LiHMDS(双三甲基硅基氨基锂)作用下形成烯胺盐中间体,使用苯甲酰氯和乙酰氯对该中间体进行捕捉,只能生成少量的酰化产物(亲核取代产物),而反应主要生成的是酰化中间产物继续被另一分子亚胺酸酯加成所得到的取代-加成产物。通过对酰化试剂的筛选发现:使用较短直链酰氯(乙酰氯、丙酰氯等),有利于生成取代-加成产物。但是,增加短链酰氯的投料当量,也可将酰化产物控制为反应的主产物。当使用较短直链的酰基五氟苯酚酯作为酰化试剂时,也可以得到取代-加成产物,产率为48-93%,并能保持良好的非对映选择性(大于20:1)。随着酰化试剂(酰氯、酰基五氟苯酚酯)的羰基α-位取代基位阻的增大,烯胺盐中间体对长链或大位阻酰基酰化产物的进一步加成受阻,取代-加成产物的产率降低,反应主要生成酰化产物,产率为69～96%,非对映选择性大于17:1。对酰化产物和取代-加成产物进行初步的衍生化,发现酰化产物通过DIBAL-H立体选择性还原后得到的β-羟基亚胺酸酯,产物的绝对构型和N-叔丁基亚磺酰基亚胺酸酯在Ti Cl(Oi Pr)/NEt体系以及KHMDS体系中与相应的醛反应所得aldol产物构型相同。因此该反应可作为N-叔丁基亚磺酰亚胺酸酯aldol反应的有益补充。试图通过盐酸或I等反应条件脱除取代-加成产物的叔丁基亚磺酰基,均未能成功,得到比较混杂的反应混合物。取代-加成产物经硫酸水解能获81%产率的双酰胺产物;用DIBAL-H可还原得到83%产率的还原产物。本论文发展了一种制备β-羰基亚胺酯化合物的方法。利用叔丁基亚磺酰基的手性诱导实现了N-叔丁基亚磺酰亚胺酯的非对映选择性酰化反应。此外,亚胺酸酯与直链酰氯制得的酰化产物通过立体选择性还原得到的β-羟基亚胺酸酯,弥补了亚胺酯目前只能与芳基醛以及支链醛进行aldol反应的局限。

关键词：手性N-叔丁基亚磺酰亚胺酰化取代-加成 Adol产物

丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的制备及其质量研究

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丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的制备及其质量研究

作者：陆欢欢浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的胶原蛋白作为一种独特的生物材料,具有较低的免疫原性、较高的生物相容性和修复功能,因此被广泛运用于医疗、保健、美容等领域。传统胶原蛋白的提取主要以动物皮肤为原材料,而以动物跟腱作为原料的较少。我国不属于疯牛病疫区,牛资... 详细信息

目的胶原蛋白作为一种独特的生物材料,具有较低的免疫原性、较高的生物相容性和修复功能,因此被广泛运用于医疗、保健、美容等领域。传统胶原蛋白的提取主要以动物皮肤为原材料,而以动物跟腱作为原料的较少。我国不属于疯牛病疫区,牛资源安全且丰富,因此本课题以牛跟腱为原料,通过提取条件的筛选获得最佳提取工艺,并通过丁二酸酐与胶原蛋白的酰化反应,解决天然胶原蛋白在生理环境中溶解度差的问题,制备一种具有较好溶解度和组织修复功能的材料。方法1.本文通过单因素实验筛选牛跟腱胶原蛋白的最佳提取条件,通过氨基酸分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热变性温度、圆二色谱、红外光谱,分析胶原蛋白三螺旋结构与特征。2.用斑马鱼尾鳍再生和斑马鱼col1a1b基因的相对表达量实验来论证胶原蛋白的促进组织再生功效;用十二烷基硫酸钠诱导斑马鱼炎症的模型来论证胶原蛋白的抗炎功效。3.通过单因素实验筛选丁二酸酐酰化胶原蛋白的最佳反应条件,并制备丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒。通过对丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的等电点、溶解时间的研究,分析丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的溶解度;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热变性温度、圆二色谱、红外光谱,分析酰化后的胶原蛋白的三螺旋结构与特征。4.用新西兰兔评价皮肤刺激实验、白化豚鼠评价皮肤致敏试验、体外细胞毒性试验来论证丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的安全性。结果1.牛跟腱胶原提取的最佳时间为72h,最佳温度为25℃,最佳用酶量为3%。通过氨基酸分析,其中特征性的强脯氨酸含量为13.5%;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得到牛跟腱胶原蛋白的分子量接近300kd,热变性温度为69.9℃;圆二色谱、红外光谱,均有胶原蛋白特征峰。斑马鱼尾鳍再生功效为23%,P酰化胶原蛋白的最佳反应条件为pH9、反应温度为25℃、丁二酸酐的用量为20%。制备的丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒等电点为3.82,溶解时间为60s～90s,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量偏高,热变性温度为67.4℃;圆二色谱、红外光谱显示丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒均有胶原蛋白特征峰;4.动物实验研究丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒安全性的结果为丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒皮肤刺激性小、无致敏反应、无细胞毒性试验。结论本课题以牛跟腱胶原蛋白为研究对象,设计并优化了牛跟腱胶原蛋白的提取方案,获得了Ⅰ型胶原蛋白。并用热变性温度、圆二色谱、红外光谱等各项验证方法验证了制备的牛跟腱胶原蛋白具有三螺旋结构。用斑马鱼动物实验证明了牛跟腱胶原蛋白具有促进组织修复和抗炎的功效。通过丁二酸酐酰化胶原蛋白,获得了改性胶原蛋白。丁二酸酐酰化胶原蛋白等电点偏低,易溶解,溶解时间在60s～90s。并且同样用热变性温度、圆二色谱、红外光谱等各项验证方法,验证了制备的丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒仍然具有三螺旋结构,说明其主要生物活性保留。此外,用皮肤刺激实验、皮肤致敏实验、细胞毒性实验,证明了丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒具有较高安全性。

关键词：牛跟腱胶原蛋白丁二酸酐酰化三螺旋结构

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光催化烯基醛与肟酯的酰化/环化反应研究

光催化烯基醛与肟酯的酰化/环化反应研究

作者：李学娇湖南理工学院

学位级别：硕士

含氧的杂环化合物广泛存在于自然界,其中有很多有生物活性,可以作为药物的先导化合物。其中3-取代-4-色满酮是一类最有意义的结构骨架。4-色满酮支架广泛存在于天然产物、生物体内的具有活性的化合物以及药物分子中,是有很大研究应用价... 详细信息

含氧的杂环化合物广泛存在于自然界,其中有很多有生物活性,可以作为药物的先导化合物。其中3-取代-4-色满酮是一类最有意义的结构骨架。4-色满酮支架广泛存在于天然产物、生物体内的具有活性的化合物以及药物分子中,是有很大研究应用价值的特殊结构基序。正因为其有广泛的生理和生物活性,开发有效的合成方法来获得4-色满酮衍生物一直是有机化学界的研究热点。光催化作为一种温和而强大的工具,因为它可以克服碳-碳键裂解的困难而引起人们的极大兴趣。通过自由基反应裂解碳-碳键,可预测和有效的键重组,在构建各种分子框架中发挥着越来越重要的作用。本文重点探讨了在光催化条件下,可见光介导的烯烃双酰化反应,用于在氮中心自由基(NCRs)策略下通过肟酯的碳-碳键裂解合成3-取代-4-色满酮类化合物。本研究主要包括以下内容:(1)对烯基醛与肟酯酰化/环化反应进行了一系列反应条件优化,以2-(烯丙氧基)苯甲醛和丁二酮O-(4-(三氟甲基)苯甲酰)单肟为模板最终筛选出最佳反应条件,反应可以以80%的产率获得目标产物。(2)对烯基芳醛与肟酯酰化/环化反应进行了详细的底物拓展和研究。在光催化的条件下,合成了一系列3-取代-4-色满酮衍生物,产率均在70%以上。由于不同位点的取代基会影响到3-取代-4-色满酮类化合物的生物活性,合成结构多样化的3-取代-4-色满酮,可能赋予其新的或放大的生物活性和应用。因此,进行不同位点的多取代的4-色满酮的合成实验,是非常必要的。(3)开发了可见光诱导的烯烃双酰化反应,在温和的条件下合成了3-取代-4-色满酮。该策略以三(2-苯基吡啶)合铱作为光催化剂,肟酯作为酰基化试剂,运用氮中心自由基(NCRs)策略,通过碳-碳键的断裂来制备3-取代-4-色满-酮化合物的合成提供了一条温和高效的途径。

关键词：光催化 4-色满酮酰基肟酯酰化环化

基于聚多巴胺的磁性纳米生物催化剂高效催化二氢杨梅素酰化（英文）

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Chinese Journal of Catalysis 2016年第4期37卷 584-595页

作者：邓啸曹诗林李宁吴虹 Thomas J.Smithd 宗敏华娄文勇华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室广东广州510640 华南理工大学食品科学与工程学院应用生物催化实验室广东广州510640 华南理工大学化学与化工学院广东广州510640 谢菲尔德哈勒姆大学生物分子科学研究中心

脂肪酶是一种三酰基甘油水解酶,目前广泛用于油脂化学、食品、有机合成和生物医药等领域.但是,游离脂肪酶在有机反应体系中容易失活,难以从反应体系中回收,导致其循环利用困难和生产成本增加.因此,需要对游离脂肪酶进行固定化,提高酶的... 详细信息

脂肪酶是一种三酰基甘油水解酶,目前广泛用于油脂化学、食品、有机合成和生物医药等领域.但是,游离脂肪酶在有机反应体系中容易失活,难以从反应体系中回收,导致其循环利用困难和生产成本增加.因此,需要对游离脂肪酶进行固定化,提高酶的稳定性和重复使用性,使其能够大规模用于工业生产.磁性四氧化三铁纳米粒子(MNPs)具有其超顺磁性和大比表面积等性质,但MNPs需表面修饰才能进一步应用.近年来,仿生矿化法制备的聚多巴胺纳米材料受到人们关注.在仿生矿化过程中,单体多巴胺经自聚合作用后形成聚多巴胺,该反应活性高,能对各类有机和无机纳米材料进行表面修饰.而且,聚多巴胺表层中的活性基团能与含有氨基和巯基的生物大分子发生迈克尔加成或席夫碱反应,从而将生物大分子固定在材料表面.本文利用聚多巴胺表面修饰MNPs,对所得聚多巴胺表面修饰的四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs)进行了结构表征.结果表明,PD-MNPs尺寸在14 nm左右.同时,成功将黑曲霉脂肪酶(ANL)固定在PD-MNPs上,结果显示在pH=8、固定化时间为12 h条件下,酶负载量为138 mg/g,酶活回收率达到83.6%,而且固定化酶的pH稳定性及热稳定性、储藏稳定性都优于游离酶.动力学研究表明,固定化酶Km值(63.2 mmol/L)低于游离酶(74.5 mmol/L),固定化酶的底物亲和性增强.进一步研究了固定化酶和游离酶在乙腈、二甲基亚砜、乙醇和[HMIm]BF_4这四种溶剂中的溶剂耐受性,结果显示固定化酶的耐受性均强于游离酶.采用红外光谱对游离酶和固定化酶二级结构的分析表明,游离黑曲霉脂肪酶经固定化后,α-螺旋和β-折叠含量分别增加了0.84%和2.74%,使得固定化后α-螺旋和β-折叠中存在的氢键能够更好地保持酶结构刚性,避免因结构改变而引起酶失活,增强了固定化酶在溶剂中的耐受性.二氢杨梅素是一种具有类黄酮结构的天然产物,具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和保护肝脏等作用,但其脂溶性很差,很难透过细胞膜被人体吸收.本课题组曾首次以乙酸乙烯酯为酰基供体,采用游离脂肪酶生物催化方法成功将二氢杨梅素酰化.本文考察了PD-MNPs固定化脂肪酶在二氢杨梅素酰化反应中的应用.结果表明,与游离酶相比,固定化酶在反应介质二甲基亚砜中的耐受性更强,反应48 h后其催化二氢杨梅素酰化的转化率接近80%,明显好于游离酶(69%).固定化酶催化二氢杨梅素酰化的最适底物摩尔比、温度和酶量分别为10:1(乙酸乙烯酯:二氢杨梅素)、45 ℃,和40 U.此外,固定化酶在外界磁场作用下能迅速从反应混合物中分离,从而可回收利用,在重复使用10次后,其活性仍保持在初始活性的55%以上,具有良好的工业应用前景.

关键词：磁性四氧化三铁纳米粒子聚多巴胺黑曲霉脂肪酶二氢杨梅素酰化