HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白相互作用的初步研究

作     者：巩雪俐 

作者单位：新疆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张建龙;成军

授予年度：2010年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：人胰腺CDK5RAP3蛋白 HBV表面抗原大蛋白 代谢综合征 免疫共沉淀 亚细胞定位 

摘      要：目的:为进一步研究HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与宿主胰腺细胞的相互作用。方法:1.将酵母细胞表达载体pGBKT7-LHBs转化AH109酵母菌株,与含有胰腺细胞文库质粒的Y187酵母菌株进行配合,行酵母双杂交,筛选人胰腺中LHBs结合蛋白基因。2.应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR),扩增人胰腺CDK5RAP3基因。3.构建真核表达质粒pcDNA-3.1 -myc-his-CDK5RAP3,通过真核表达系统,应用免疫共沉淀技术及Western blotting方法证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内的相互作用关系。4.构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,通过真核表达系统,应用哺乳动物双杂交技术证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内的相互作用关系。5.构建CDK5RAP3的红色荧光表达载体pDsRed1-N1-CDK5RAP3,将其与绿色荧光表达载体pEGFP-LHBs分别转染Capan2细胞,模拟该蛋白在细胞中的表达,在激光共聚焦显微镜下观察LHBs及CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位。结果:1.成功筛选出人胰腺细胞中11种与LHBs存在相互作用的已知功能蛋白,其中包括羧肽酶B1、胰凝乳蛋白C、人类胰蛋白酶原2、线粒体蛋白基因、组织相容性复合体13、乌头酸酶1、蛋白酶2、辅脂肪酶以及核糖体蛋白L10a等已知功能蛋白。2.成功扩增人胰腺CDK5RAP3基因。3.成功构建CDK5RAP3基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-CDK5RAP3,同pcDNA3.1(-)LHBs行免疫共沉淀,证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系。4.成功构建CDK5RAP3基因的真核表达载体pACT-CDK5RAP3,同pBIND-LHBs等共转染Capan 2细胞,行哺乳动物双杂交,证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系。5.成功构建CDK5RAP3的红色荧光表达载体,并在Capan2细胞中得到表达。激光共聚焦显微镜观察到LHBs及CDK5RAP3蛋白均主要定位于细胞浆中。结论:本实验成功筛选人胰腺中LHBs结合蛋白基因,并且证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用,为下一步研究LHBs的作用机制奠定基础。