Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜屏障功能和吸收功能的调控作用

作     者：邓宸玺 

作者单位：江西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：游金明

授予年度：2013年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：仔猪 Ala-Gln 小肠 屏障功能 吸收功能 

摘      要：本项目旨在应用现代技术手段，探讨Ala-Gln调控仔猪小肠黏膜屏障功能和吸收功能的作用机理，研究结果将为指导Ala-Gln在仔猪饲料中的科学应用提供理论依据。 试验一Ala-Gln对断奶仔猪生长性能、小肠黏膜形态结构与功能的影响 试验选取100头遗传背景和体重相近的21日龄断奶去势大白公仔猪，采用单因子试验设计，按完全随机区组法分为4个处理，每个处理5个重复，每个重复5头仔猪。各处理仔猪分别饲喂基础饲粮、基础饲粮＋0.15%Ala-Gln、基础饲粮＋0.30%Ala-Gln、基础饲粮＋0.45%Ala-Gln的试验饲粮。从试验开始到结束，每天记录仔猪腹泻头数，每周对各重复的仔猪进行空腹称重，并记录饲料消耗量，计算采食量、日增重以及料重比。同时，于试验第7、14、21天从每个重复选取1头仔猪进行屠宰，采集血清、小肠黏膜、小肠粘液以及小肠肠段，用于测定血清二胺氧化酶（DAO）、小肠黏膜磷脂酶A2（cPLA2）、小肠黏液溶菌酶活性及绒毛形态，并观察空肠绒毛超微结构。结果表明：（1）日粮中添加Ala-Gln能显著改善断奶仔猪的平均日增重、料重比及腹泻率。与对照组相比，21-28、28-35日龄试验组仔猪日采食量和日增重均获显著提高（P0.05），其中0.30%Ala-Gln极显著提高了21-28日龄仔猪的日增重（P0.01）并降低了仔猪的料重比（P0.05）。日粮中添加0.45%Ala-Gln，21-28、28-35、35-42日龄仔猪的腹泻率和腹泻指数均显著低于对照组（P0.05）。（2）日粮中添加Ala-Gln可有效提高仔猪十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度和V/C，降低隐窝深度。其中，0.15%、0.30%Ala-Gln组的效果最为明显（P0.05）。透射电镜下观察发现，对照组空肠微绒毛排列紊乱、异位并伴有脱落现象，而Ala-Gln处理组仔猪空肠绒毛整齐度良好，尤其以0.30%Ala-Gln组效果最明显。（3）0.30%Ala-Gln显著降低了35日龄仔猪血清的DAO活性（P0.05），而0.15%、0.30%Ala-Gln显著降低了42日龄仔猪的DAO活性（P0.05）;日粮中随着Ala-Gln添加水平的增加，42日龄仔猪cPLA2的含量呈线性增加趋势（P0.05），其中0.45%Ala-Gln组cPLA2显著高于对照组（P0.01）。仔猪小肠黏液溶菌酶活性在三个阶段均显著高于对照组（P0.05）。综上可知，Ala-Gln可降低仔猪血清DAO活性、提高小肠黏膜cPLA2和黏液溶菌酶活性，改善小肠绒毛形态结构，进而促进仔猪小肠的黏液屏障功能，并提高仔猪的生长性能。 试验二Ala-Gln对断奶仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin定位与表达的影响 本研究旨在应用仔猪小肠上皮细胞系IPEC-1为模型，探讨丙氨酰-谷氨酰胺二肽（Ala-Gln）对仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin定位与表达的影响，进而为揭示Ala-Gln促进仔猪小肠黏膜屏障功能的作用机制提供理论依据。试验选取同代IPEC-1细胞接种至6孔细胞培养板，用含0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mMAla-Gln的高糖DMEM进行培养，待细胞生长融合达70%以上时进行免疫荧光定位和Western blot。结果表明：（1）不含Ala-Gln的对照组细胞可见其胞质内团状的阳性荧光染色，而细胞间连接处阳性荧光染色不明显;随着Ala-Gln含量的增加，细胞间连接处阳性荧光信号逐渐增强，细胞轮廓更加完整，而胞质内荧光信号逐渐减弱。（2）各Ala-Gln处理组IPEC-1细胞紧密连接蛋白Occludin的表达量均显著高于对照组（P0.01）。随着Ala-Gln含量的升高，Occludin的表达量呈现先增后减的趋势，添加量为2mM时Occludin的表达量达到峰值，显著高于其它处理组（P0.01）。由此可知，Ala-Gln可以增加IPEC-1细胞紧密连接蛋白Occludin的表达，促进小肠上皮细胞间紧密连接结构的形成。 试验三Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜二糖酶活性及钠葡萄糖转运蛋白SGLT1、GLUT2mRNA表达的影响 试验选取100头遗传背景和体重相近的21日龄断奶去势大白公仔猪，采用单因子试验设计，按完全随机区组法分为4个处理，每个处理5个重复，每个重复5头仔猪。各处理仔猪分别饲喂基础饲粮、基础饲粮＋0.15%Ala-Gln、基础饲粮＋0.30%Ala-Gln、基础饲粮＋0.45%Ala-Gln的试验饲粮。于试验第7、14、21天从每个重复选取1头仔猪进行屠宰，取十二指肠、空肠和回肠黏膜样品，分别测定Na+/K+-ATP酶、乳糖酶、麦芽糖酶及蔗糖酶的活性，并采用荧光定量RT-PCR方法测定钠葡萄糖转运蛋白（SGLT1）和葡萄糖转运蛋