新疆家蚕抗菌肽的优化表达及活性检测
作者单位:新疆大学
学位级别:硕士
导师姓名:张富春;马纪
授予年度:2014年
学科分类:0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种]
主 题:新疆家蚕抗菌肽 优化表达 抑菌活性 体征指标 毒理反应 商业应用
摘 要:抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体免疫防卫系统产生的防御性多肽活性物质,能够对抗外源性病原体的致病作用,在机体的先天免疫中起重要作用。抗菌肽通常由1200个氨基酸残基组成,多含疏水性氨基酸,多数是两亲性阳离子肽。根据氨基酸组成和结构特征,抗菌肽可分为天蚕素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)和蜂毒素(melittins)。抗菌肽是一种无毒副作用、无残留、无细菌耐药性的环保型制剂,具有热稳定性、水溶性好、广谱杀菌甚至能杀灭真菌、原虫等优点。因此,有关抗菌肽及其应用逐渐成为人们的研究热点,并且在消毒产品应用与开发上具有潜在的商业价值。 新疆家蚕抗菌肽(CecropinXJ)基因从阿克苏新蚕3号蚕体中克隆获得,已在原核和真核系统成功表达。CecropinXJ属于天蚕素-B类家族,具两亲性α-螺旋区域,信号肽26个氨基酸,成熟肽37个氨基酸,具有强热稳定性和酸稳定性,抗菌谱广,对多种癌细胞具有细胞毒性作用,在食品加工行业及消毒产品的开发方面具有潜在应用价值。 本研究通过优化条件表达得到CecropinXJ,采用小鼠灌胃的方法对小鼠体征指标和脏器组织影响进行研究,初步检测CecropinXJ毒理效应,并进一步对CecropinXJ抗菌产品的潜在商业应用价值进行了评价。 本研究工作主要包括三个内容: 1.新疆家蚕抗菌肽的优化表达 通过优化培养基不同C:N配比、不同诱导时间以及不同诱导剂浓度,获得CecropinXJ原核表达的最佳条件是37℃、1.28mmol/L IPTG诱导4h、培养基N:C为1:4。经超声破碎后,取蛋白上清液,融合蛋白表达量达菌体总蛋白的50%以上,经亲和纯化后获得目的蛋白,纯度可达80%以上。按上述条件进行诱导,定量分析显示,CecropinXJ融合蛋白的表达量达10mg/L。蛋白纯化最佳条件为:结合缓冲液的浓度为50mmol/L,洗杂缓冲液的浓度为100mmol/L,洗脱缓冲液的浓度为250mmol/L。通过对细菌和真菌的抑菌实验表明,CecropinXJ能有效抑制细菌和真菌生长。 2.新疆家蚕抗菌肽对小鼠体征指标和脏器组织影响的研究 通过对CecropinXJ灌胃小鼠的体征指标和胃及肝脏组织的病理组织学检测,研究表明,高纯度大剂量(40mg/kg/d,纯度85%)CecropinXJ仅对实验小鼠肝脏系数有部分影响,对小鼠的生长生活、体重及其它脏器系数均无显著影响;其他剂量CecropinXJ对实验小鼠脏器系数无明显影响。石蜡切片结果表明小鼠胃和肝脏对未纯化总蛋白均无明显的毒理性反应和病理变化,而高纯度大剂量(40mg/kg/d,纯度85%)的CecropinXJ对小鼠肝脏有毒理和病理影响。 3.新疆家蚕抗菌肽的商业化应用及开发价值评价 CecropinXJ对鲜榨果汁防腐效果的影响研究表明,适当浓度的CecropinXJ添加到鲜榨果汁中,可以有效抑制细菌生长,保持鲜榨果汁原有营养成分和风味,延长保鲜期。在两种鲜榨果汁中,CecropinXJ对番茄汁或葡萄汁抑菌效果均非常明显,且呈现不同的抑菌动态变化形式,可能与CecropinXJ在食品基质成分间的相互作用有关。由于不同果汁其组成成分、pH和微生物菌群等不同,影响到抗菌肽的生物活性,具体原因有待进一步研究和探讨。 根据CecropinXJ的广谱抑菌作用,利用手掌表面菌对CecropinXJ的日常应用可能进行了初步探索。通过不同浓度CecropinXJ的抑菌实验和平板菌落计数表明,随着CecropinXJ浓度的升高,对手掌擦拭液中细菌的抑制效果越强,相较于对照组有显著性差异(p0.05)。对CecropinXJ抑制的菌群的属性鉴定结果表明,CecropinXJ能明显有效抑制手掌表面革兰氏阴性菌的生长。 以上研究表明,CecropinXJ可作为生活及医用消毒产品的开发,并具有一定的商业价值。