美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

作     者：黄建松 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：詹金彪

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：核糖体失活蛋白 美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ HIV-1整合酶 细胞毒性 

摘      要：[目的] 美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins,PAPs)是在美洲商陆(phytolacca amercana)的不同组织或不同生长阶段合成的一类具有酶功能的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs),有多种类型,即PAP-Ⅰ,PAP-Ⅱ,PAP-Ⅲ,PAP-S,PAP-R,分别来自春天的叶片、初夏的叶片、晚夏的叶片、种子、根。美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweed antiviral proteinⅡ),具有RNA N-糖苷酶的活性,能专一地从真核生物核糖体28S rRNA的第4324位和原核生物核糖体23S rRNA的第2600位切下一腺嘌呤,干扰延伸因子EF-2催化GTP的水解,从而阻碍了蛋白质的合成。最近的研究表明PAP-Ⅱ蛋白能抑制HIV病毒在内的多种病毒,也有研究将其构建成免疫毒素,用于杀伤肿瘤细胞。本实验室利用基因工程方法,从新鲜的美洲商陆夏季的叶片中成功的克隆了PAP-Ⅱ的基因,插入到原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功地表达了PAP-Ⅱ蛋白,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗病毒、抗肿瘤的作用机理提供研究平台。[方法] 根据报道的cDNA序列,设计合成两条引物,在两条引物上分别添加HindⅢ、Nde Ⅰ酶切位点,用RT-PCR的方法从夏季的美洲商陆新鲜的叶片中克隆PAP-Ⅱ基因,与T载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,经过Nde Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定阳性亚克隆,送生工测序。对确定含有PAP-Ⅱ基因的阳性亚克隆,用限制性内切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ对阳性亚克隆产物双酶切,目的基因片段切胶