胰淀粉样蛋白（IAPP）参与高脂诱导的胰岛细胞损伤效应及机制研究
作者单位：兰州大学
学位级别：硕士
导师姓名：景玉宏
授予年度：2014年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：目的肥胖是Ⅱ型糖尿病的重要发病因素,肥胖多伴随高脂血症、高胰岛素血症及胰岛素抵抗,上述代谢异常也是Ⅱ型糖尿病的常见表现。胰岛素分泌往往伴随胰淀粉样蛋白(IAPP)的增多,IAPP的寡聚化易导致IAPP的沉积,参与胰岛细胞的损伤。肥胖及高脂血症患者血液中IAPP含量升高,但升高的IAPP是否参与了胰岛β细胞的损伤,亦或只是胰岛素水平升高的伴发现象,目前尚不清楚。方法1、体重250g左右2个月大小的SD雄性大鼠随机分四组,两组给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,30mg/kg, i.p)一次,一星期后检测血糖,比正常组升高50%左右,用于实验。高血糖大鼠随机分为两组,一组给予普通饲料喂养(STZ);另一组给予高脂饮食饲养(STZ+HD)。两组给予等剂量的无菌柠檬酸缓冲液腹腔注射一次,一星期后检测血糖,随机分为两组,一组给予普通饮食喂养(Normal);另一组给予高脂饮食饲养(HD)。四组动物连续饲养2个月后检测葡萄糖耐量及胰岛素敏感性实验。动物处死,自心脏采血,离心分离血浆,采用酶比色法测大鼠血中葡萄糖及甘油三酯的浓度。分离胰腺,石蜡包埋,切片机切片,片厚5μm,HE染色法定位胰岛并观察形态,免疫组化方法结合半定量分析胰岛细胞中胰岛素受体(IR),Amylin及P53的表达水平。2、体外培养INS-1细胞。取对数期生长的细胞加入不同浓度的棕榈酸钠,利用MTT法检测细胞的存活率,确定高脂损伤的细胞模型及合适的药物浓度。用ELISA方法检测棕榈酸钠对INS-1细胞胰岛素释放的影响。利用Q-RT-PCR技术检测棕榈酸钠对INS-1细胞Insulin,Amylin mRNA水平的影响。利用Western blotting技术检测棕榈酸钠对INS-1细胞IR及P53蛋白表达的影响。3、hIAPP对INS-1细胞的损伤效应。取对数生长期的细胞,调整合适的细胞浓度。称量合成的hIAPP多肽放入EP管中,加入HFIP使hIAPP浓度为250μmol/L,把EP管储存于室温(约22℃)的黑暗环境中5-24 h。通N2使HIFP蒸发,把管内表面上的肽溶于无菌水中,使HFIP-treated hIAPP在水中的最终浓度500μmol/L,此时hIAPP多肽形成寡聚体形式,进而处理细胞。用ELISA方法检测hIAPP对INS-1细胞胰岛素释放的影响。利用Q-RT-PCR技术检测hIAPP对INS-1细胞Insulin, Amylin mRNA水平的影响。利用Western blotting技术检测hIAPP对INS-1细胞IR及P53蛋白的表达的影响。结果1、动物实验结果表明,SD大鼠在造模2月后,和正常组比较,其余3组血糖及血甘油三酯的含量升高,其中STZ组血糖升高最明显,HD组血脂升高最明显。HD组葡萄糖耐受最为显著,HD组胰岛素敏感性下降最为明显。利用免疫组织化学结合半定量技术检测,发现STZ组、HD组.HD+STZ组胰岛素受体(IR)在胰岛部位的表达,和正常组比较明显下降;Amylin在胰岛部位表达和正常组比较,HD组及HD+STZ组升高明显,而STZ组和正常组比较变化不明显;P53在胰岛区的表达可见,HD组及STZ+HD的表达水平明显高于正常组。2、棕榈酸钠对INS-1细胞的损伤研究表明：随着棕榈酸钠浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,细胞的损伤加强。Q-RT-PCR结果显示棕榈酸钠诱导Insulin及Amylin的mRNA水平随浓度增加而增加。Western blotting结果显示在棕榈酸钠作用下,INS-1细胞的IR蛋白水平的表达随着棕榈酸钠浓度增高而减少,而P53蛋白的表达则逐渐增加。3、hIAPP寡聚体对INS-1细胞的损伤效应。研究结果表明20μmol/L,及50μmol/L浓度的hIAPP寡聚体导致INS-1细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平升高,P53表达明显增加。结论1、高脂饮食可以导致大鼠出现胰岛素抵抗,胰岛细胞的自分泌调节能力下降,Amylin分泌增加,伴随胰岛细胞损伤。2、游离脂肪酸直接处理INS-1细胞,可以诱导Amylin高表达,胰岛素分泌增加,但伴随自身胰岛素信号下降,且P53表达增高,表现为INS-1细胞的损伤。3、给予hIAPP寡聚体处理INS-1细胞,可以诱导类似脂类损伤的相似结果,表现为细胞膜结构的完整性受到影响,INS-1细胞损伤。4、高脂诱导的胰岛细胞损伤部分依赖于胰岛细胞分泌的Amylin, Amylin大量分泌成为胰岛细胞损伤的因素之一。
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