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Human islet amyloid polypeptide:A therapeutic target for the management of type 2 diabetes mellitus

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Journal of Pharmaceutical Analysis 2022年第4期12卷 556-569页

作者： Pratiksha H.Roham Shreyada N.Save Shilpy Sharma Department of Biotechnology Savitribai Phule Pune UniversityGaneshkhind41100India

Type 2 diabetes mellitus(T2DM)and other metabolic disorders are often silent and go unnoticed in patients because of the lack of suitable prognostic and diagnostic markers.The current therapeutic regimens available for managing T2DM do not reverse diabetes;instead,they delay the progression of diabetes.Their efficacy(in principle)may be significantly improved if implemented at earlier stages.The misfolding and aggregation of human islet amyloid polypeptide(hiapp)or amylin has been associated with a gradual decrease in pancreatic b-cell function and mass in patients with T2DM.Hence,hiapp has been recognized as a therapeutic target for managing T2DM.This review summarizes hiapp's role in mediating dysfunction and apoptosis in pancreatic b-cells via induction of endoplasmic reticulum stress,oxidative stress,mitochondrial dysfunction,inflammatory cytokine secretion,autophagy blockade,etc.Furthermore,it explores the possibility of using intermediates of the hiapp aggregation pathway as potential drug targets for T2DM management.Finally,the effects of common antidiabetic molecules and repurposed drugs;other hiapp mimetics and peptides;small organic molecules and natural compounds;nanoparticles,nanobodies,and quantum dots;metals and metal complexes;and chaperones that have demonstrated potential to inhibit and/or reverse hiapp aggregation and can,therefore,be further developed for managing T2DM have been discussed.

关键词： Aggregation Inhibitor Therapeutic target hiapp Type 2 diabetes mellitus

功能化氧化石墨烯和缺陷介孔二氧化硅抑制Ⅱ型糖尿病中hiapp聚集的研究

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功能化氧化石墨烯和缺陷介孔二氧化硅抑制Ⅱ型糖尿病中hIAPP聚集...

作者：周贤波暨南大学

学位级别：硕士

Ⅱ型糖尿病(T2DM)是蛋白错误折叠成β结构淀粉样蛋白沉淀的内分泌疾病。大量的研究表明这种蛋白沉淀的主要成分是人类胰岛淀粉样蛋白(hiapp)。h IAPP错误折叠形成低聚物和成熟纤维的过程伴随着细胞凋亡,细胞凋亡可能是由于氧化应激,线... 详细信息

Ⅱ型糖尿病(T2DM)是蛋白错误折叠成β结构淀粉样蛋白沉淀的内分泌疾病。大量的研究表明这种蛋白沉淀的主要成分是人类胰岛淀粉样蛋白(hiapp)。h IAPP错误折叠形成低聚物和成熟纤维的过程伴随着细胞凋亡,细胞凋亡可能是由于氧化应激,线粒体损伤或者细胞膜通透性的改变造成的。避免h IAPP形成有毒性的纤维是治疗Ⅱ型糖尿病的一个合理方法。基于Ⅱ型糖尿病的发病机理,本论文设计合成了一种氧化石墨烯负载胰岛素衍生物的纳米复合物和另外一种缺陷发光介孔二氧化硅负载h IAPP部分片段甲基化的纳米粒子,系统地研究了这两类纳米粒子在抑制h IAPP纤维化及其减少细胞毒性的作用,并深入探讨了它们抑制h IAPP聚集的作用机制。本论文一共分为三章:第一章,简单的介绍了Ⅱ型糖尿病,及其发病机理,hiapp在发病过程的作用及hiapp聚集机制的探讨。接着综述了各种药物及纳米材料在hiapp聚集中的研究进展,最后阐述了本课题的选题意义及目的。第二章,我们设计合成了用聚乙二醇(PEG)和胰岛素衍生物(EALYLV)修饰的氧化石墨烯为药物的纳米复合物(nGO@PEG@E),纳米氧化石墨烯(nGO)能够吸附hiapp单体,这样可以减少溶液中游离的h IAPP浓度达到了抑制它聚集成纤维的目的。EALYLV是胰岛素衍生物,它能够特异性的结合hiapp,能够与hiapp侧链上的Arg11形成一个很强的盐桥,它也能够从Arg11跨越到hiapp残基上的Phe15阻断分子形成纤维的主要作用区域,从而抑制它的聚集。纳米复合物nGO@PEG@E不仅能够抑制hiapp的聚集还可以保护INS-1细胞不受h IAPP毒性的影响,稳定线粒体膜电位,减少细胞内的活性氧。第三章,h IAPP是一个37个氨基酸的多肽,片段8-20,20-29和30-37有能力形成纤维。NFGAIL作为一个短的hiapp淀粉样蛋白聚集的核,它有能力自组装成β折叠结构和有细胞毒性的纤维。NF(N-Me)GA(N-Me)IL能够特异性的结合并且抑制h IAPP的聚集。缺陷介孔二氧化硅(DLMSNs)更加有利于细胞吸收的研究。本文我们合成了壳聚糖修饰并负载了N-Me)GA(N-Me)IL的DLMSNs(DL@CS@NF),它能够抑制h IAPP的聚集,在TEM和AFM的实验中明显的可以看到经过DL@CS@NF处理后的h IAPP几乎看不见成熟的纤维,在细胞实验中DL@CS@NF能够减少hiapp产生的细胞毒性和活性氧达到保护细胞的目的。总之,纳米粒子DL@CS@NF可以作为Ⅱ型糖尿病治疗的潜在药物。

关键词： Ⅱ型糖尿病 hiapp 纳米氧化石墨烯缺陷介孔二氧化硅胰岛素衍生物

精氨酸-半胱氨酸二肽修饰的金团簇调控Aβ和hiapp纤维化

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精氨酸-半胱氨酸二肽修饰的金团簇调控Aβ和hIAPP纤维化

作者：罗卓英武汉理工大学

学位级别：硕士

迄今已有20多种疾病被临床医学认定为蛋白质构象病,包括以阿兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)为代表的神经退行性疾病和以Ⅱ型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)为代表的局限性疾病。所有蛋白质构象病都有一个共同的病理特征——即存在一种... 详细信息

迄今已有20多种疾病被临床医学认定为蛋白质构象病,包括以阿兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)为代表的神经退行性疾病和以Ⅱ型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)为代表的局限性疾病。所有蛋白质构象病都有一个共同的病理特征——即存在一种或多种蛋白/多肽发生错误折叠和异常纤维化进而在体内形成不溶的纤维沉积斑块。常见的主要包括AD中的β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)和T2D中的人胰岛淀粉样多肽(Human islet amyloid polypeptide,hiapp)等。目前的研究表明,对致病蛋白错误折叠与异常纤维化的抑制只能实现对相应蛋白质构象病的预防或延缓病程,对于那些致病蛋白已经错误折叠并形成纤维化沉积斑块的患者则无治疗作用因此,开发抑制致病蛋白错误折叠和纤维化,且对致病蛋白纤维具有拆解效果的新型药物材料是目前生物医学界研究的一大热点领域,具有极大的挑战和前沿的研究意义。此外,由于这类疾病发病与氧化应激密切相关,开发具有良好抗氧化性和良好生物利用率的蛋白纤维化抑制材料也非常重要。本文将在课题组前期实验发现不同配体修饰的金纳米团簇(AuNCs)分别对Aβ和hiapp纤维化有优异抑制效果的基础上,尝试通过优化AuNCs配体来实现上述目标,具体研究内容如下:(1)采用精氨酸(R)半胱氨酸(C)的二肽CR和RC为配体,用一锅法制备出CR-AuNCs和RC-AuNCs两种团簇,通过UV-vis,TEM、FTIR、DLS、XPS等表征方法对制备出的CR-AuNCs和RC-AuNCs分别进行表征,发现两种AuNCs的粒径均在2 nm以下,两种配体CR和RC均通过Au-S与金核相连接。细胞毒性实验证明二者在0-100 mg·L浓度范围内均无细胞毒性,显示了优异的生物相容性。随后将两种AuNCs分别加入到Aβ和hiapp溶液中进行纤维化抑制实验,发现CR-AuNCs和RC-AuNCs对Aβ纤维化的抑制均呈现剂量依赖性,分别在50 mg·L和25 mg·L可以实现对Aβ纤维化的完全抑制,显示两种AuNCs都对Aβ纤维化具有优异抑制效果。然而CR-AuNCs和RC-AuNCs对hiapp则都无法完全抑制纤维生长,仅仅呈现出剂量依赖的延缓纤维生长。通过蛋白(Aβ或hiapp)诱导损伤细胞模型实验来探索CR-AuNCs和RC-AuNCs对蛋白诱导损伤细胞的修复效果,结果表明两种AuNCs均可以通过抑制Aβ的纤维化过程来缓解其细胞毒性,但两种AuNCs均无法缓解hiapp纤维化造成的细胞毒性。(2)进一步选择抑制效果较好的RC-AuNCs进行Aβ蛋白纤维拆解实验,同样采用Th T荧光标记法、AFM和DLS来监控成熟Aβ纤维拆解过程,发现拆解过程同样具有剂量依耐性,25 mg·LRC-AuNCs可以将成熟Aβ纤维拆解成无毒的纳米级团簇-蛋白复合物。原位实时CD光谱监测拆解过程中Aβ纤维的二级结构变化发现在纤维拆解过程中伴随着Aβ蛋白聚集体构象由β-折叠向α-螺旋和无规转变,即逆转了Aβ蛋白错误折叠和纤维化过程中发生的由无规和α-螺旋向β-折叠转变。进一步的Aβ纤维损伤细胞模型实验表明RC-AuNCs通过拆解成熟纤维可有效缓解甚至消除了原本Aβ纤维化聚集造成的细胞毒性。(3)在前期工作基础上,选用天然提取物阿魏酸(Fumalic acid,FA)对CR-AuNCs进行二次修饰得到FA-CR-AuNCs,将FA-CR-AuNCs用于Aβ纤维化的抑制实验。结果发现FA-CR-AuNCs对Aβ蛋白纤维化呈现出剂量依赖性的抑制效果。CD光谱显示FA-CR-AuNCs可以抑制Aβ蛋白由非折叠态向β-折叠转变。细胞模型实验表明FA-CR-AuNCs可以通过抑制Aβ蛋白纤维化而减轻该过程带来的细胞毒性。同时对FA-CR-AuNCs总抗氧化能力(T-AOC)进行检测,发现FA-CR-AuNCs的抗氧化能力较CR-AuNCs有大幅提升,达到谷胱甘肽的1/3,表明其具有抗氧化应激的潜力。这些结果表明FA-CR-AuNCs不仅可以抑制致病蛋白Aβ的错误折叠和异常纤维化,而且具有一定的抗氧化能力,有潜力从多靶点多通路来防治AD。综上所述,本文针对AD重大挑战,成功研发出一种具有拆解成熟Aβ纤维能力的金团簇RC-AuNCs,一种同时对致病蛋白Aβ纤维化具有抑制效果且具有良好抗氧化活性的金团簇FA-CR-AuNCs,本论文不仅为AuNCs用于AD的新药研发积累了基础数据,而且为蛋白质构象病的药物研发提供了新的见解。

关键词：金团簇蛋白质构象病 Aβ40 hiapp 纤维化

人胰岛淀粉样多肽hiapp单体及二聚体与POPG磷脂膜相互作用的分子动力学模拟研究

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人胰岛淀粉样多肽hIAPP单体及二聚体与POPG磷脂膜相互作用的分子...

作者：张贇复旦大学

学位级别：硕士

二型糖尿病的发病与人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide-hiapp或Amylin)的病理性聚集密切相关。越来越多的实验数据表明hiapp的细胞毒性很可能是由hiapp聚集形成的低聚体与人β细胞膜的相互作用导致的,因此研究hiapp-细... 详细信息

二型糖尿病的发病与人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide-hiapp或Amylin)的病理性聚集密切相关。越来越多的实验数据表明hiapp的细胞毒性很可能是由hiapp聚集形成的低聚体与人β细胞膜的相互作用导致的,因此研究hiapp-细胞膜的相互作用对了解hiapp的细胞毒性机理有着非常重要的意义。然而,由于实验方法在空间分辨和时间分辨上的局限性,目前对hiapp与细胞膜相互作用过程的原子水平信息并不完全了解。分子动力学模拟可以给出原子尺度上二者相互作用的详细过程,从而弥补实验方法的不足。本文中,我们采用全原子分子动力学模拟研究了hiapp单体(monomer)及二聚体(dimer)与POPG磷脂膜的相互作用过程。能量分析显示,静电作用,尤其是带正电的Lys1、Arg11与POPG磷脂膜的静电吸引,在hiapp与磷脂的相互作用过程中起主导作用。在这一过程中,hiapp的二聚化主要通过肽链C端的20-37这个片段完成。对二聚体与单体体系中位于POPG分子亲水头部的磷原子位置涨落、疏水尾巴序参数SCD以及POPG膜厚度的对比分析表明：hiapp二聚体对POPG磷脂膜稳定性的影响远高于单体,并且这种影响来自于二聚体内部肽链之间相互作用的协同性,这种协同性有可能是hiapp低聚体毒性的来源。这些研究结果对进一步理解hiapp与生物膜的相互作用以及hiapp低聚体破坏生物膜的分子机制具有重要作用。

关键词： hiapp POPG生物双层膜蛋白-膜相互作用分子动力学

酪氨酸硝基化对hiapp聚集性质的影响研究

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酪氨酸硝基化对hIAPP聚集性质的影响研究

作者：魏晶晶华中科技大学

学位级别：硕士

2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2D)最重要的病理特征之一是人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hiapp)发生聚集。研究结果显示,hiapp单体发生错误折叠后产生的寡聚体和纤维具有一定的细胞毒性,会导致胰岛β细胞的丧失,进... 详细信息

2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2D)最重要的病理特征之一是人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hiapp)发生聚集。研究结果显示,hiapp单体发生错误折叠后产生的寡聚体和纤维具有一定的细胞毒性,会导致胰岛β细胞的丧失,进一步引发2型糖尿病。此外,高血糖条件下往往诱发氧化和氮化应激,此环境可能导致hiapp中酪氨酸发生硝化,生成硝基化的hiapp(3NT-hiapp)。我们前期研究表明,虽然3NT-hiapp抑制了hiapp聚集成为纤维的能力,但却加剧了其诱导的细胞毒性。因此,本文采用了荧光探针、瑞利光散射、动态光散射、荧光显微镜、核磁共振氢谱(H-NMR)、Zeta电位检测等技术,研究二者在聚集方面的差异性及其产生差异性的原因,为进一步阐明T2D发病机理提供理论基础。主要研究成果如下:(1)通过对二者聚集特性比较,发现二者的迟滞时间差异性相近,但增长期进一步成长为纤维的速率存在一定的差异。具体为3NT-hiapp在增长期的速率显著慢于hiapp。对应的,我们发现,在聚集过程中,3NT-hiapp形成聚集物的尺寸始终小于hiapp,且其形成聚集物的形貌多为小尺寸的非纤维状聚集物,显著不同于hiapp形成的纤维状聚集物。(2)通过对二者聚集差异性的原因进行分析研究,发现二者单体及其寡聚物所带的电荷以及形成低聚物的结构是造成该差异的主要原因。通过Zeta电位实验,我们发现,hiapp硝化后,其表面电荷发生改变使其电位绝对值下降,进一步降低了其类“胶体”聚集中间体的稳定性,使其不易聚集成长为纤维;通过H-NMR实验,我们进一步发现硝化后的hiapp,其聚集形成的低聚物具有较为松散的肽链,这种独特结构是使3NT-hiapp不易聚集成长为纤维的另一重要原因。

关键词： hiapp 3NT-hiapp 聚集

基于分子模拟探究五种类黄酮抑制hiapp聚集与NtMGAM活性的机制

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基于分子模拟探究五种类黄酮抑制hIAPP聚集与NtMGAM活性的机制

作者：王宇重庆大学

学位级别：硕士

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是现代医学和公共卫生领域的主要挑战之一。抑制人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hiapp,也称Amylin)聚集并降低其低聚物的毒性、抑制N末端麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(Nt-Maltase... 详细信息

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是现代医学和公共卫生领域的主要挑战之一。抑制人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hiapp,也称Amylin)聚集并降低其低聚物的毒性、抑制N末端麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(Nt-Maltase-Glucoamylase,NtMGAM)酶活性是治疗和控制T2DM病情发展的潜在策略:hiapp寡聚体可导致抑制代谢功能,诱导氧化应激和细胞凋亡,并破坏细胞膜,使胰岛β细胞发生凋亡,导致胰岛素产生减少;作为具有α葡萄糖苷酶活性的NtMGAM酶,由于其活性位点的结合口袋较浅,难以被阿卡波糖所抑制。据文献报道,在常见的食品中广泛存在的五种天然类黄酮(染料木素(Genistein),芦丁(Rutin),槲皮素(Quercetin),表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)和水飞蓟宾(Silibinin)),已通过传统实验证明它们对hiapp聚集有效的解离作用,但它们抑制hiapp寡聚体的聚集的详细机制仍不清楚。基于此,本论文通过分子对接和分子动力学模拟的计算机模拟方法探索了五个类黄酮抑制hiapp聚集的机制;并且探索这五种类黄酮是否可以竞争性抑制T2DM另一个靶标NtMGAM酶的活性,目的是探索这五种类黄酮是否能够双靶向的治疗和控制T2DM病人的病情发展。本论文的主要研究结果如下:通过五种类黄酮与hiapp计算模拟结果表明:(1)这五种类黄酮可以通过与hiapp的两个区域(Leu-Ala-Asn和Asn-Val-Gly-Ser-Asn)结合从而解聚了与hiapp直接接触的链A和链B;(2)抑制hiapp聚集的能力为:Genistein>Rutin>Quercetin>EGCG>Silibinin;(3)这五种类黄酮表现出hiapp五聚体解聚的相似机制:它们使两条直接接触的肽链松散,从而可能破坏hiapp寡聚物;(4)通过关键氨基酸残基突变分子动力学模拟表明:hiapp第28(Ser),第12(Leu)和第32(Val)氨基酸残基对hiapp五聚体的结构稳定性具有重要影响。这3个氨基酸关键残基可能是设计抗hiapp聚集抑制剂的潜在靶标。通过五种类黄酮与NtMGAM计算模拟结果表明:(1)NtMGAM活性口袋内部偏向与糖环和芳香环结合;EGCG和Rutin具有抑制NtMGAM活性的潜能,它们与活性口袋结合能力优于阿卡波糖;(2)五元糖环与活性口袋结合能力优于六元糖环;这表明嵌入酶活性口袋的结构不宜过大;(3)溶剂分子是影响着抑制剂分子与NtMGAM活性口袋结合稳定性的一个关键性因素;在设计NtMGAM的抑制剂中,活性口袋外侧可能需要一种屏蔽溶剂的结构,减少溶剂对抑制剂的扰动。以上结果表明,EGCG与Rutin可能具有抑制hiapp聚集和NtMGAM的双靶向的作用。在探索抑制hiapp聚集机制发现3个关键的靶点;在探索NtMGAM酶活性的抑制剂,其中抑制剂结构中屏蔽外界的溶剂干扰表现得至关重要。通过此项工作,可能有助于通过原子级别探究类黄酮抑制hiapp聚集和抑制NtMGAM活性的机制,并将有助于筛选,修饰和设计新的抑制剂。

关键词：类黄酮 hiapp NtMGAM 分子对接分子动力学模拟

Structural Effects of L16Q, S20G, and L16Q-S20G Mutations on hlAPP： A Comparative Molecular Dynamics Study

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Chinese Journal of Chemistry 2012年第2期30卷 241-248页

作者： Wang,Mian Yang,Jipeng Wang,Jianyi Wang,Xiaojuan School of Chemistry and Chemical Engineering Guangxi UniversityNanningGuangxi 53004China Jiyuan Vocational and Technical College JiyuanHenan 459000China

The conformation change picture of human islet amyloid polypeptide （hlAPP） is outlined using molecular dynamics simulation, and the structural influences of L16Q, S20G, and L16Q-S20G mutations on the conformation of hlAPP are analyzed. Particularly, the conformational changes of the amyloidogenic-related regions of residues 15-- 17 and 20--29 are emphasized. Our studies find that, for WT hlAPP, residues 15--17 always maintain a stable a-helix structure, residues 20--25 structurally fluctuate between turn and 5-helix, and residues 26--29 mainly adopt coil and bend structures. The hydrogen bonds between the polar groups of hlAPP, long-rang van der Waals forces between the residues, and hydrophobic interactions between the residues of hlAPP are important driving forces to maintain the secondary structure of hlAPP. The replacement of leucine 16 by glutamine stabilizes the helix structure of residues 15--17 and 20--23 of hlAPP monomer, and the structure of residues 24--29 fluctuates be- tween helix and turn. The relatively stable helix structures of residues 15--17 and 20--29 are supposed to be beneficial for L16Q hlAPP to resist the aggregation as observed in the experiment. The substitution of serine20 by glycinc drives residues 15--17 and 20--29 of hlAPP to transform from helix structure to β-strands or coil structures with higher extension and flexibility, which may promote the aggregation of hlAPP as the experiments reported. These results are significant to understand the aggregation mechanism of hlAPP monomer into the dimer, trimer, oligomers and fibrils associated with the type 2 diabetes at the atomic level.

关键词： hiapp wild type mutant molecular dynamics simulation

人淀粉样胰岛多肽在磷脂双层膜表面吸附和取向的分子动力学模拟研究

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人淀粉样胰岛多肽在磷脂双层膜表面吸附和取向的分子动力学模拟研...

作者：贾彦复旦大学

学位级别：硕士

蛋白质错误折叠和聚集会导致诸如阿尔兹海默症和二型糖尿病等严重的慢性疾病。人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide-hiapp或Amylin)是在二型糖尿病患者的胰腺中发现的淀粉样沉淀的主要成分。越来越多的实验数据显示人β... 详细信息

蛋白质错误折叠和聚集会导致诸如阿尔兹海默症和二型糖尿病等严重的慢性疾病。人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide-hiapp或Amylin)是在二型糖尿病患者的胰腺中发现的淀粉样沉淀的主要成分。越来越多的实验数据显示人β细胞膜毒性与能够加快聚集的hiapp和细胞膜相互作用密切相关。但是由于实验方法在空间分辨和时间分辨上的局限性,对于hiapp与细胞膜相互作用过程,尤其是相互作用的最初阶段并不清楚,分子动力学模拟可以在原子尺度上给出二者相互作用的详细过程,从而弥补实验方法的不足。本文中,作为了解hiapp和膜相互作用的第一步,我们使用全原子动力学(MD)模拟从原子水平研究了hiapp和膜相互作用的最初阶段,包括吸附、取向及hiapp单体的构象变化等。我们发现hiapp单体很快的吸附到磷脂双分子层上,对于带负电的POPG磷脂双分子膜,hiapp的N端最先吸附是由于强烈的静电相互作用,尤其是带正电的氨基酸K1和R11起到了很大的作用。两性的POPC膜,则N端和C端基本等几率优先吸附;hiapp基本平行吸附到膜表面,氨基酸7-22保持稳定的α螺旋,这和过去的实验结果一致;特别的是,两种膜体系有两个不同的吸附面,POPG体系是氨基酸R11,F15和S19朝向膜,POPC体系是氨基酸T9,N14和H18。

关键词：二型糖尿病蛋白质错误折叠 hiapp 磷脂双分子膜动力学吸附过程吸附取向蛋白-膜相互作用分子动力学模拟

胰淀粉样蛋白（IAPP）参与高脂诱导的胰岛细胞损伤效应及机制研究

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胰淀粉样蛋白（IAPP）参与高脂诱导的胰岛细胞损伤效应及机制研究

作者：莫晓丹兰州大学

学位级别：硕士

目的肥胖是Ⅱ型糖尿病的重要发病因素,肥胖多伴随高脂血症、高胰岛素血症及胰岛素抵抗,上述代谢异常也是Ⅱ型糖尿病的常见表现。胰岛素分泌往往伴随胰淀粉样蛋白(IAPP)的增多,IAPP的寡聚化易导致IAPP的沉积,参与胰岛细胞的损伤。肥胖及... 详细信息

目的肥胖是Ⅱ型糖尿病的重要发病因素,肥胖多伴随高脂血症、高胰岛素血症及胰岛素抵抗,上述代谢异常也是Ⅱ型糖尿病的常见表现。胰岛素分泌往往伴随胰淀粉样蛋白(IAPP)的增多,IAPP的寡聚化易导致IAPP的沉积,参与胰岛细胞的损伤。肥胖及高脂血症患者血液中IAPP含量升高,但升高的IAPP是否参与了胰岛β细胞的损伤,亦或只是胰岛素水平升高的伴发现象,目前尚不清楚。方法1、体重250g左右2个月大小的SD雄性大鼠随机分四组,两组给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ,30mg/kg, i.p)一次,一星期后检测血糖,比正常组升高50%左右,用于实验。高血糖大鼠随机分为两组,一组给予普通饲料喂养(STZ);另一组给予高脂饮食饲养(STZ+HD)。两组给予等剂量的无菌柠檬酸缓冲液腹腔注射一次,一星期后检测血糖,随机分为两组,一组给予普通饮食喂养(Normal);另一组给予高脂饮食饲养(HD)。四组动物连续饲养2个月后检测葡萄糖耐量及胰岛素敏感性实验。动物处死,自心脏采血,离心分离血浆,采用酶比色法测大鼠血中葡萄糖及甘油三酯的浓度。分离胰腺,石蜡包埋,切片机切片,片厚5μm,HE染色法定位胰岛并观察形态,免疫组化方法结合半定量分析胰岛细胞中胰岛素受体(IR),Amylin及P53的表达水平。2、体外培养INS-1细胞。取对数期生长的细胞加入不同浓度的棕榈酸钠,利用MTT法检测细胞的存活率,确定高脂损伤的细胞模型及合适的药物浓度。用ELISA方法检测棕榈酸钠对INS-1细胞胰岛素释放的影响。利用Q-RT-PCR技术检测棕榈酸钠对INS-1细胞Insulin,Amylin mRNA水平的影响。利用Western blotting技术检测棕榈酸钠对INS-1细胞IR及P53蛋白表达的影响。3、hiapp对INS-1细胞的损伤效应。取对数生长期的细胞,调整合适的细胞浓度。称量合成的hiapp多肽放入EP管中,加入HFIP使hiapp浓度为250μmol/L,把EP管储存于室温(约22℃)的黑暗环境中5-24 h。通N2使HIFP蒸发,把管内表面上的肽溶于无菌水中,使HFIP-treated hiapp在水中的最终浓度500μmol/L,此时hiapp多肽形成寡聚体形式,进而处理细胞。用ELISA方法检测hiapp对INS-1细胞胰岛素释放的影响。利用Q-RT-PCR技术检测hiapp对INS-1细胞Insulin, Amylin mRNA水平的影响。利用Western blotting技术检测hiapp对INS-1细胞IR及P53蛋白的表达的影响。结果1、动物实验结果表明,SD大鼠在造模2月后,和正常组比较,其余3组血糖及血甘油三酯的含量升高,其中STZ组血糖升高最明显,HD组血脂升高最明显。HD组葡萄糖耐受最为显著,HD组胰岛素敏感性下降最为明显。利用免疫组织化学结合半定量技术检测,发现STZ组、HD组.HD+STZ组胰岛素受体(IR)在胰岛部位的表达,和正常组比较明显下降;Amylin在胰岛部位表达和正常组比较,HD组及HD+STZ组升高明显,而STZ组和正常组比较变化不明显;P53在胰岛区的表达可见,HD组及STZ+HD的表达水平明显高于正常组。2、棕榈酸钠对INS-1细胞的损伤研究表明：随着棕榈酸钠浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,细胞的损伤加强。Q-RT-PCR结果显示棕榈酸钠诱导Insulin及Amylin的mRNA水平随浓度增加而增加。Western blotting结果显示在棕榈酸钠作用下,INS-1细胞的IR蛋白水平的表达随着棕榈酸钠浓度增高而减少,而P53蛋白的表达则逐渐增加。3、hiapp寡聚体对INS-1细胞的损伤效应。研究结果表明20μmol/L,及50μmol/L浓度的hiapp寡聚体导致INS-1细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平升高,P53表达明显增加。结论1、高脂饮食可以导致大鼠出现胰岛素抵抗,胰岛细胞的自分泌调节能力下降,Amylin分泌增加,伴随胰岛细胞损伤。2、游离脂肪酸直接处理INS-1细胞,可以诱导Amylin高表达,胰岛素分泌增加,但伴随自身胰岛素信号下降,且P53表达增高,表现为INS-1细胞的损伤。3、给予hiapp寡聚体处理INS-1细胞,可以诱导类似脂类损伤的相似结果,表现为细胞膜结构的完整性受到影响,INS-1细胞损伤。4、高脂诱导的胰岛细胞损伤部分依赖于胰岛细胞分泌的Amylin, Amylin大量分泌成为胰岛细胞损伤的因素之一。

关键词：胰岛β细胞 hiapp 高脂