低氧下BM-MSCs内HMGB1的表达及HMGB1对BM-MSCs凋亡、粘附影响的体外研究

作     者：张才东 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭美云

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：低氧 间充质干细胞 HMGB1 粘附 凋亡 

摘      要：目的低氧预处理能够调节间充质干细胞(MSCs)的生存能力,但其下的具体机制尚不完全清楚。在低氧下,多种细胞内的HMGB1水平可以通过细胞分泌及凋亡相关的途径而升高,它可能参与了细胞生物活性的调节。本研究将证实低氧能够诱导骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)表达HMGB1,同时研究HMGB1对BM-MSCs凋亡及粘附性的影响,为改善移植干细胞的生存力提供新的依据和策略。方法(1)从Sprague-Dawley大鼠股骨、胫骨骨髓中分离培养出骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),经流式细胞仪对培养的细胞进行表型鉴定及纯度检测。(2)将贴壁80%-90%的第三代BM-MSCs分别置于低氧(1%O2)培育箱和常氧(20%O2)培育箱培育24小时后,收获细胞分别进行RT-PCR及western blot检测,分别比较常氧、低氧下BM-MSCs内HMGB1 m RNA及HMGB1蛋白表达的差异性。(3)使用无血清的培养基来诱导细胞凋亡。将第三代BM-MSCs接种在12孔的培养盘中,给与无血清培养基的同时,给予不同浓度的HMGB1蛋白(0,10,50,100和200ng/ml)共培养,24小时后使用Annexin V/PI试剂盒染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。(4)在12孔培养盘内加入1μg/cm2浓度的纤维连接蛋白(FN)进行铺板,以促进细胞粘附。在细胞接种到培养盘后,给予不同浓度的HMGB1蛋白进行干预,培育24小时后,直接细胞计数法检测细胞的粘附性。结果(1)低氧条件下的BM-MSCs表达HMGB1 m RNA、HMGB1蛋白的量均明显比常氧条件下的表达要高(P0.05)。(2)不同浓度的HMGB1干预无血清培养基内的BM-MSCs 24小时后,流式细胞仪检测结果显示:随着HMGB1浓度的增加,不同浓度组的细胞凋亡率有先增加后降低的趋势。与浓度为0ng/ml HMGB1组的细胞凋亡率相比较,浓度在50ng/ml和100ng/ml时,细胞凋亡率明显的增加(P0.05),浓度在10ng/ml和200ng/ml时,细胞凋亡率的差异无统计学意义。(3)随着HMGB1浓度的增加,不同浓度组的细胞粘附数量均增加。与浓度为0ng/ml HMGB1组的细胞粘附数量相比较,浓度在50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml时,细胞粘附数量的增加具有统计学意义(P0.05)。结论(1)低氧可以明显的诱导BM-MSCs表达HMGB1。(2)一定浓度的HMGB1可以诱导BM-MSCs凋亡,尤其当HMGB1浓度在50ng/ml和100ng/ml时。但随着HMGB1浓度的增加,这种诱导凋亡的作用呈减弱趋势。(3)HMGB1可以提高BM-MSCs粘附性能,且呈浓度依赖趋势。(4)低氧调节MSCs生存力的机制可能与它上调HMGB1的表达,影响MSCs的生物学性质相关