猪瘟病毒高感染性PK-15细胞单克隆细胞株的筛选

作     者：孔令芸 

作者单位：河南科技学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李敬玺;银梅;王选年

授予年度：2015年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：CSFV 猪瘟病毒 细胞生长 PK-15 单克隆细胞株 亲代细胞 病毒滴度 病毒蛋白 瘟病毒属 swine 

摘      要：猪瘟(Classical Swine Fever)，早期称猪霍乱(Hog Cholera, HC)，是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病，其特征为高热稽留和全身广泛性出血。猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），是RNA病毒，具有感染性。CSFV在猪体内复制增殖，破坏机体多种细胞，使猪迅速发病并死亡。而在体外细胞培养中，CSFV并不能使细胞产生病理变化。CSFV在体外增殖的病毒滴度较低，而提高病毒滴度对研究CSFV的分子生物学特性和免疫学特性，以及制备CSFV单抗和疫苗都具有非常重要的作用。 猪瘟病毒是单股正链线性RNA病毒，ORF编码一个由3898个氨基酸组成的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞酶的作用下，形成至少12种成熟的病毒蛋白。用于CSFV分子流行病学分析的核苷酸片段主要有NS5B、E2和5’UTR等，其中NS5B和E2可用来精确区分毒株。根据CSFV的NS5B、E2和E0基因分群的结果一致，初步认为这3个基因在系统发生分析中具有高度的一致性。本研究通过设计E0、E2和NS5B基因特异性引物，扩增目的片段，然后通过测序及序列分析，确定使用的CSFV与shimen株同源性最高，为后续试验奠定背景基础。 PK15细胞广泛应用于CSFV的分离与培养，但是其不均一性导致了病毒培养滴度不高。研究表明猪瘟病毒在体外培养中释放的病毒的量与细胞感染数量（阳性细胞）有关，所以提高细胞感染数量同时提高感染速度对提高病毒滴度有至关重要的作用。研究显示感染PCV2的PK15细胞培养物，约有20％PK-15细胞是PCV2易感的细胞群，该研究表明PK-15细胞的异质性与PCV2滴度的高低有密切关系。本实验通过IPMA检测发现CSFV对PK-15的感染也仅仅只有20%左右，所以获得均一的PK-15细胞有助于提高CSFV滴度。CSFV病毒滴度，即50％组织细胞感染剂量（TCID50），得到每毫升PK15细胞培养通常从104到105不等。为了获得均一的、针对培养CSFV高病毒滴度的PK15细胞，本研究通过有限稀释法对PK15亲代细胞进行克隆，获得两株PK15细胞克隆株，分别为PK15-1A6和PK15-3B1，与PK15亲代细胞相比，PK15-1A6和PK15-3B1TCID50分别能达到106.8TCID50/mL和103.61TCID50/mL，而PK15亲代细胞的TCID50则为104.88TCID50/mL。PK15-1A6单克隆细胞株感染CSFV的强度远远高于PK15母细胞，为以后CSFV疫苗评价及诊断研究奠定了基础。