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Investigation on the co-infections of Toxoplasma gondii with PRRSV, csfv or PCV-2 in swine in part of China

Journal of Integrative Agriculture 2015年第9期14卷 1838-1844页

作者： WANG Shuai ZHANG Meng LIU Xin-chao LIN Tao YANG Han-chun YUAN Shi-shan ZHAO Guang-wei IA Hassan YAN Ruo-feng SONG Xiao-kai XU Li-xin LI Xiang-rui College of Veterinary Medicine Nanjing Agricultural University Department of Swine Infectious Diseases Shanghai Veterinary Research InstituteChinese Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis Ministry of Agriculture/State Key Laboratory of AgrobiotechnologyCollege of Veterinary MedicineChina Agricultural University

The objective of the present investigation was to estimate the prevalence of Toxoplasma gondii infection and co-infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), classical swine fever virus(csfv) and porcine circovirus type 2(PCV-2) in pigs in China. A total of 372 tissues or serum samples collected from pigs distributed in 9 provinces/municipalities of China during the period from February 2011 to November 2012 were assayed for T. gondii antigens and antibodies using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) technique, while the PCR was designed for the detection of the PRRSV, csfv and PCV-2, respectively. The total positive rate of T. gondii, PRSSV, csfv and PCV-2 was 9.14%(34/372), 50.00%(186/372), 37.10%(138/372) and 3.23%(12/372), respectively. Among the 34 T. gondii positive samples, 26 samples were simultaneously infected with T. gondii and viruses, while the remaining eight samples were infected with T. gondii alone. In addition, the co-infection rate of T. gondii with PRSSV, T. gondii with PRSSV and csfv, T. gondii with PRSSV and PCV-2, T. gondii with csfv and PCV-2, T. gondii with PRSSV, csfv and PCV-2 was 1.61%(6/372), 4.03%(15/372), 0.27%(1/372), 0.27%(1/372) and 0.81%(3/372), respectively. The results of the present survey revealed that PRRSV and csfv were the common pathogens co-existing with porcine toxoplasmosis in China, and both of them could increase the chances of T. gondii infection in pig. This is the first report of T. gondii co-infections with viruses in pigs. It is very important to understand the interactions of parasite and virus, and can be used as reference data for the control and prevention of co-infections of T. gondii and viruses in pigs.

关键词： Toxoplasma gondii coinfection PRRSV csfv PCV-2 pig

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Secretory Expression of E2 Main Antigen Domain of csfv C Strain and the Establishment of Indirect ELISA Assay

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Virologica Sinica 2008年第5期23卷 363-368页

作者： Guo-zhen LIN Chang-qing QIU Fu-ying ZHENG Ji-zhang ZHOU Xiao-an CAO Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture State Key Laboratory of Veterinary EtiologicalBiology Lanzhou Veterinary Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Lanzhou Gansu730046 China

The sequence encoding an E2 main antigen glycoprotein of the C strain of classical swine fever virus (csfv) was highly expressed in the host cell E. coli BL21–CodonPlus (DE3)–RIL using the pGEX-4T-1 expression vector and the soluble recombinant product was purified with Glutathione Sepharose TM4B by centrifugation. The soluble recombinant protein showed good immune reactions and was confirmed by Western blot using anti-csfv-specific antibodies. Then an indirect ELISA with the purified E2 protein as the coating antigen was established to detect antibody against csfv. The result revealed that the optimal concentration of coated antigen was 0.6 μg/well and the optimal dilution of serum was 1:80. The positive cut-off value of this ELISA assay was OD tested serum / OD negative serum≥2.1. The E2-ELISA method was evaluated by comparison with the indirect hemagglutination test (IHAT). When a total of 100 field serum samples were tested the sensitivity and specificity were 90.3% and 94.7% respectively. Specificity analysis showed that there were no cross-reactions between BVD serum and the purified E2 protein in the E2-ELISA.

关键词： csfv C strain E2 gene Indirect ELISA Secretory Expression

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同时检测csfv、PRRSV、PRV及PCV2多重荧光定量PCR方法的建立

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中国预防兽医学报 2015年第11期37卷 850-855页

作者：何世成周其伟张浩旭王卫国鲁信花唐小明周玲玲湖南省动物疾病预防控制中心湖南长沙410007 中山大学达安基因股份有限公司广东广州510665 广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司广东广州510330

为建立可以同时检测猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的csfv、PRRSV、PRV和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了... 详细信息

为建立可以同时检测猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的csfv、PRRSV、PRV和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系。对csfv、PRRSV、PRV和PCV2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性。灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL。此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5%,表明所建立的方法具有很好的重复性。利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86%;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07%(26/59);无4种病毒同时感染的样本。以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对csfv、PRRSV、PRV和PCV2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控。

关键词： csfv PRRSV PRV PCV2 荧光定量PCR

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Investigation on the co-infections of Toxoplasma gondii with PRRSV,csfv or PCV-2 in swine in part of China

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者： Shuaiwang Meng Zhang Xinchao Liu Tao Liu HanchunYang ShishanYuan Guangwei Zhao Hassan I.A Ruofeng Yan Xiaokai Song Lixin Xu Xiangrui Li College of Veterinary Medicine Nanjing Agricultural University

【Objective】The objective of the present investigation was to estimate the prevalence of Toxoplasma gondii infection and co-infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),classical swine fever virus(csfv)and porcine circovirus type 2(PCV-2)in pigs in China.【Method】A total of 372 tissues or serum samples collected from pigs distributed in 9provinces/municipalities of China during the period from February 2011 to November 2012 were assayed for *** antigens and antibodies using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)technique,while the PCR was designed for the detection of the PRRSV,csfv and PCV-2,respectively.【Result】The total seropositive rate of *** was found in 34(9.14%)out of 372 samples.A total of186 samples were positive for PRSSV and the positive rate was 50.00%.The positive rates of csfv and PCV-2 were 37.10%(138/372)and 3.23%(12/372),*** the 34 *** sero-positive samples,8 samples were infected with *** alone,while the remaining 26 samples were simultaneously infected with *** and one of the PRSSV,csfv and PCV-2,or the combination of 3 *** co-infection rate of *** with PRSSV,*** with PRSSV and csfv,*** with PRSSV and PCV-2,*** with csfv and PCV-2,*** with PRSSV,csfv and PCV-2 was 1.61%(6/372),4.03%(15/372),0.27%(1/372),0.27%(1/372)and 0.80%(3/372),respectively.【Conclusions】The results of the present survey revealed that PRRSV and csfv were the common pathogens co-existing with porcine toxoplasmosis in China,and both of them could increase the chances of *** infection in *** results of the present survey indicated that *** infection in pigs was as high as 9.14%in China,and the high infection of *** in pigs might be a risk to the safety of animal origin food and public *** and csfv were the common pathogens co-existing with porcine toxoplasmosis in China,and both of them could increase the chances of *** infection in *** is th

关键词： Toxoplasma gondii co-infection PRRSV csfv PCV-2 pig

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csfv、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装

CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂...

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作者：罗忠永四川农业大学

学位级别：硕士

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装GeXP多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室... 详细信息

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装GeXP多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室其他类似课题研究成果,最终建立基于GeXP技术的猪体重要疫病的高通量诊断技术。研究方法:1、选定核酸作为病原诊断的指示物,参考病原全基因组序列比对分析研究成果,遵循特异保守的原则,选定csfv5UTR序列、HP-PRRSVNSP2基因、ASFV B646L基因、PEDV M基因作为核酸检测区段;从NCBI数据库下载各病原相应核酸序列,使用生物学软件比对分析根据毒株间保守区域设计引物;特别地,设计的HP-PRRSV诊断引物要能区分PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株。2、根据实验设计的引物建立单病原PCR诊断方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析单病原单重PCR的特异性;利用体外转录合成的csfv、HP-P RRSV、PEDVRNA标准品和构建的ASFV质粒分析单病原单重PCR的灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析引物设计是否符合设计预期。3、以鉴定符合设计预期的引物,参考GeXP实验指导建立本研究的4种病原GeXP多重检测方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析4种病原GeXP多重检测方法的特异性;通过RNA标准品和质粒分析4种病原GeXP多重检测方法的单病原和多病原灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析本实验建立的4种病原GeXP多重检测方法的可行性。4、根据实验成果组装GeXP多重检测试剂盒,使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;以单病原检疫标准方法作为参考,分析本实验组装的试剂盒的相对特异性、相对灵敏度、符合率;根据实验结果分析该试剂盒的临床应用价值。结果:1、单病原单重PCR实验结果显示本实验设计的引物能特异性地检出csfv、H P-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMDV、PP V、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;各病原单重PCR的灵敏度为102copies/μl;根据HP-PRRSV NSP2基因缺失区设计的引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;本实验设计的引物符合实验预期,能够用于GeXP多重检测方法的建立。2、根据GeXP实验指导建立的4种病原GeXP多重检测方法能够特异性地检出csfv、HP-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMD V、PPV、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;设计的HP-PRRSV引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;GeXP多重检测方法的单病原检测灵敏度在102copies/μl～103copies/μl之间,GeXP多重检测方法的多病原检测灵敏度为103copies/μl;本实验建立的GeXP多重检测方法具有很好的特异性和灵敏度,可以用于组装GeXP多重检测试剂盒,探究临床应用价值。3、基于结果3组装GeXP多重检测试剂盒;使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;本实验组装的GeXP多重检测试剂盒的相对特异性和相对灵敏度均为100%,符合率为97%～100%。结论:本实验成功建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装了检测试剂盒;通过对临床病料的检测及与单病原检疫标准方法对比证实该试剂盒具有很好的临床应用价值。

关键词： csfv HP-PRRSV ASFV PEDV GeXP多重PCR

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Immunostimulatory RNA from the transcription intermediates of the genome of csfv trigger innate immune response via TLR7

Immunostimulatory RNA from the transcription intermediates o...

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第十届全国免疫学学术大会

作者： Xiaobing He Huaijie Jia Yongxiang Fang Guohua Chen Shuang Zeng Zhizhong Jing 中国农业科学院兰州兽医研究所

Background:Innate immune responses are essential for the control of csfv infection and are triggered through host recognition of pathogen-associated molecular *** RNAs of RNA virus is indispensable for the production of innate immune cytokines by stimulating effector cells of the immune ***,as an important positive ss RNA virus,whether csfv-derived ss RNA can trigger the innate immune responses through the host RNAsensing receptors remain poorly ***:Porcine immune cells,PK-15,PIEC and HEK293T cells were transfected with csfv-derived is RNAs,and immune activation was ***:We found that the csfv encodes multiple G/U-rich ss RNAs that can activate IFN-α,TNF-α,IL-12 and *** particular,an effective ss RNA,RNA4529,strongly induced the production of IFN-α,TNF-α,IL-12 and *** examination of the dose-response in PBMCs to RNA4529 revealed the expected dose dependency of IFN-α,TNF-α,IL-12 and IL-6 *** addition,from 6h to 96h,the RNA4529 induced production of IFN-α,TNF-α,IL-12 and ***,the RNA4529 can induce significant cytokine secretion in PAMs,but not PK-15 and *** determine whether the innate immune activation induced by the csfv-derived ss RNAs was mediated by TLR7,we pretreated PBMCs with chloroquine and bafilomycin A1 before incubation with RNA4529 and *** results revealed that chloroquine and bafilomycin A1 can remarkably inhibit the production of IFN-α,TNF-α,IL-12 and *** addition,IRS661 and IRS954 can also reduced the production of IFN-α,TNF-α,IL-12 and IL-6,whereas IRS869did not inhibit innate immune cytokines ***,RNA4529 and gardiquimod substantially activated TLR7-mediated IFN-α1,TNF-α,NF-κB and IRF3/7 signaling in HEK293T and PK-15 transiently transfected with TLR7,whereas no response was observed transiently transfected with the control ***:These results provide an insight into is RNA motifs within the transcrip

关键词： PRRs PAMPs is RNA csfv TLR7

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PRRSV和csfv多重RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医杂志 2008年第1期44卷 33-34页

作者：邓雨修宋延华温纳相顾节清周全陈丰潮广东温氏食品集团有限公司广东新兴527439

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪瘟(CSF)都是严重危害世界养猪业的病毒性传染病。目前PRRS和CSF的危害也越来越大,而且混合感染的现象常有发生,这不但给猪病病原之间的鉴别诊断增加困难,也使猪病防制日趋复杂化。当前关于PRRSV和csfv的病... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪瘟(CSF)都是严重危害世界养猪业的病毒性传染病。目前PRRS和CSF的危害也越来越大,而且混合感染的现象常有发生,这不但给猪病病原之间的鉴别诊断增加困难,也使猪病防制日趋复杂化。当前关于PRRSV和csfv的病原学检测方法有病毒的分离鉴定、ELISA、免疫荧光、原位杂交及PCR等技术,其中PCR方法操作简便,特异性最强,敏感性最高。多重PCR是一种特殊的PCR形式,[第一段]

关键词： PCR检测方法 PRRSV 多重PCR csfv 猪繁殖与呼吸综合征病毒性传染病 ELISA PCR方法

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csfv、PRRSV和JEV多重RT-PCR检测方法的建立及PRRSV GP5和N蛋白的原核表达

CSFV、PRRSV和JEV多重RT-PCR检测方法的建立及PRRSV GP5和N蛋白的...

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作者：薛媛西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着我国现代化畜牧业的发展,养猪产业的集约化、规模化程度愈来愈高,生猪及其产品的流通日益频繁,流动范围进一步加大,猪传染病的发生与流行有加重的趋势。多病原混合感染和继发感染己成为当今猪群发病的普遍规律。免疫抑制性病毒,如... 详细信息

随着我国现代化畜牧业的发展,养猪产业的集约化、规模化程度愈来愈高,生猪及其产品的流通日益频繁,流动范围进一步加大,猪传染病的发生与流行有加重的趋势。多病原混合感染和继发感染己成为当今猪群发病的普遍规律。免疫抑制性病毒,如猪繁殖与呼吸综合征病毒,是目前危害养猪业的不可忽视的原发性病原,与其他病原混合感染后可导致猪群的高发病率和高死亡率,使临床诊断的难度大大增加。随着对各种病毒基因组分子生物学研究的不断深入,一系列基于核酸的病原检测技术不断出现,为疾病的诊断提供了实用快速的新方法。本次实验由两部分组成: ***、PRRSV和JEV多重RT-PCR检测方法的建立。猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)均能导致猪繁殖障碍性疾病,对养猪生产影响很大。本研究参照GenBank中已经发表的序列,利用DNAStar软件和Primer Premier5.0软件,针对病毒的保守性基因序列,设计了3对引物用于扩增PRRSV、csfv和JEV目的基因序列,通过对引物浓度、退火温度、Mg2+浓度等反应条件进行优化,建立起鉴别PRRSV、csfv、JEV多重RT-PCR诊断方法。结果表明:其敏感性可达到csfv 10-1 pg、PRRSV 10-2pg、JEV 10-3pg级。同时具有较好的特异性,对csfv、PRRSV、JEV已知阳性病料均能扩增出相应的片段,而对PCV2,***和ddH2O均未扩增出片段。实验结果表明,本实验建立的多重RT-PCR诊断方法具有很好的敏感性和特异性,能够对病毒进行快速的鉴别及诊断。 ***的GP5和N蛋白在大肠杆菌中的表达。以PRRSV ORF5和ORF7基因的cDNA为模板,设计了两对引物分别扩增ORF5和ORF7基因,得到的目的基因连接到pET-32a原核表达载体中,得到重组质粒pET-ORF5和pET-ORF7。经过PCR、酶切及测序分析,确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确,与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达得到分子质量约为35kD和45kD的目的蛋白,为制备抗GP5蛋白和抗N蛋白单克隆抗体提供了基础。

关键词： csfv PRRSV JEV 多重RT-PCR 原核表达

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csfv、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析

CSFV、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析

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作者：秦为坚华南农业大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical Swine Fever Virus,csfv),牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)均属于黄病毒科瘟病毒属成员,它们在结构与抗原性方面具有相似性性,能够产生交叉免疫学反应与交叉保护作用。由于这两者都能感染猪,严重影响... 详细信息

猪瘟(Classical Swine Fever Virus,csfv),牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)均属于黄病毒科瘟病毒属成员,它们在结构与抗原性方面具有相似性性,能够产生交叉免疫学反应与交叉保护作用。由于这两者都能感染猪,严重影响我国畜牧业的健康发展。csfv主要感染猪,BVDV不仅能感染小反刍而且能感染家畜,其中怀孕母猪和仔猪最易感,其病理变化与临床症状与慢性猪瘟类似。这不仅对该病的防制带来一定的困扰且对本病的判断带来困难。从核苷酸同源性来看,BVDV与csfv的核苷酸同源性约为60%,由于在血清学上存在交叉反应,容易与猪瘟相混淆,对该疾病的诊断带来影响。近年来,我国猪瘟在临床表现不典型,出现了所谓的“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”,这些所谓的不典型猪瘟病理剖检上也和典型猪瘟不相同。原因主要有以下两点,一方面可能是我国长期疫苗防控,使得猪瘟病毒在免疫压力下造成了免疫耐受,改变毒力和抗原的某些特性,另一方面可能是猪只在感染csfv的同时感染了BVDV,两者加剧了病毒的危害,对我国养殖业造成灾难性的打击。因此对猪感染BVDV的现状必须有清醒的认识并应采取必要的防范措施,并且在疫苗生产过程中,要避免疫苗中BVDV的污染。根据当前猪瘟的这种变化,并且这两种病毒感染猪后所长生的症状及其相似,临床上通过症状很难鉴别诊断这两种病毒。及时的鉴别诊断有助于后期猪场人员对这两种病毒防控,有必要建立一种能够同时对csfv和BVDV进行鉴别检测的方法。因此,本文开展以下几个方面的研究:(1)使用MGEA4.0软件比对分析csfv,BVDV的核苷酸序列,寻找各自的特异性保守区并设计各自的特异性引物;(2)通过改变PCR过程中的退火温度,优化csfv,BVDV各自的最佳退火温度;(3)使用优化好的退火温度,对csfv,BVDV以及猪场常见的几种病毒进行特异性检测;(4)通过不断改变CSVF,BVDV的浓度,检测能够扩增csfv,BVDV的最低核酸浓度,验证引物的敏感性;(5)通过双重RT-PCR检测,最后检验csfv,BVDV特异性引物所扩增的结果是否与预期结果相符。

关键词： csfv BVDV 序列比对 RT-PCR

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双重RT-qPCR鉴别csfv和BVDV方法的建立及初步应用

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中国兽医杂志 2018年第5期54卷 28-31,35页

作者：韦雪华张向东谢之景田夫林王贵升山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 北京森康生物技术开发有限公司北京怀柔101400 山东省动物疫病预防与控制中心山东济南250022

为建立猪瘟病毒(csfv)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据csfv Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 csfv和BVDV的检测... 详细信息

为建立猪瘟病毒(csfv)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据csfv Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 csfv和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,csfv阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于csfv和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

关键词： RT-qPCR csfv BVDV

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