针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源性抗体偶联药物研究

作     者：吴介恒 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：温伟红

授予年度：2016年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：PSMA 人源性抗体 抗体偶联药物 前列腺癌 肿瘤靶向治疗 

摘      要：研究背景:前列腺癌是严重威胁男性健康的常见泌尿系肿瘤。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性地高表达于前列腺癌细胞表面,是理想的治疗靶分子。抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADC)由抗体、化学药物及“连接肽(Linker)共同构成,它能协同发挥抗体药物和化学药物各自的优点,实现对肿瘤细胞的特异性杀伤,是非常有前景的抗肿瘤药物。目的:构建抗PSMA人源性抗体PSMAb的真核表达载体,在真核细胞中进行表达并纯化后,检测其生物学活性;将该抗体与化学药物美登素(DM1)偶联制备出抗体偶联药物,并在体内外验证其功能。方法:将从酵母展示scFv抗体库中筛选获得的一株抗人PSMA单链抗体的轻、重链可变区基因分别与恒定区拼接,获得完整的抗体轻、重链基因,并对基因序列进行密码子优化,使其能够在CHO细胞中高表达,将优化后抗体轻、重链基因进行合成后分别克隆入真核表达载体pCDNA3,获得分别表达抗体轻、重链的表达载体,分别命名为pCDNA3-LC和pCDNA3-HC。将轻、重链表达质粒按照4:1的比例瞬时转染CHO-S细胞进行表达,收集培养上清,利用亲和层析柱进行纯化,获得抗PSMA的全抗体PSMAb。利用细胞ELISA、间接免疫荧光染色和流式细胞术检测PSMAb的亲和力、内化活性及其与PSMA阳性细胞的结合能力。将PSMAb与近红外染料IRDye 800 CW偶联后,注射给PSMA阳性和PSMA阴性荷瘤裸鼠,检测其在体内的分布情况。将PSMAb与微管抑制剂DM1进行偶联,制备出抗体偶联药物PSMAb-DM1,并在体内外验证其对PSMA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性。结果:经测序证实PSMAb抗体的轻重链基因序列均正确,酶切鉴定证实成功构建了PSMAb抗体轻、重链的真核表达载体。瞬时转染CHO-S细胞后可有效表达PSMAb,亲和层析纯化获得了纯度较高的PSMAb蛋白。细胞ELISA、流式细胞术、间接免疫荧光染色等实验证实PSMAb具有高亲和力,能特异性地与PSMA阳性细胞结合,且可有效内化入PSMA阳性细胞。体内检测发现,IRDye 800 CW标记的PSMAb可特异性地分布于PSMA阳性肿瘤组织。将PSMAb与DM1偶联后,流式细胞术证实DM1的偶联不影响PSMAb与PSMA阳性细胞的结合能力,间接免疫荧光染色证实PSMAb-DM1仍可有效内化入PSMA阳性细胞。在体外通过Alamar Blue实验和凋亡检测证实PSMAb-DM1可有效杀伤PSMA阳性细胞,且可诱导PSMA阳性细胞凋亡。计算得出PSMAb-DM1的IC50浓度为0.12n M。体内实验证实PSMAb-DM1可有效抑制PSMA阳性肿瘤的生长。结论:1)成功构建了抗PSMA人源性抗体PSMAb轻、重链的真核表达载体。2)瞬时转染CHO-S细胞后,利用亲和层析的方法获得了高纯度的PSMAb抗体。3)细胞ELISA、流式细胞术和间接免疫荧光染色证实PSMAb具有高亲和力,可特异性结合并有效内化入PSMA阳性肿瘤细胞。4)将PSMAb与DM1偶联后,成功制备出抗体偶联药物PSMAb-DM1。5)证实PSMAb-DM1可在体外特异性杀伤PSMA阳性肿瘤细胞,可在体内有效抑制PSMA阳性肿瘤的生长。