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抗bFGF人源性抗体的瞬时表达、纯化及鉴定

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中国免疫学杂志 2010年第10期26卷 876-880页

作者：陶俊李丹邓宁王宏龚义平向军俭暨南大学生命科学技术学院抗体工程中心广州510632

目的:将一株人源性中和性抗bFGF单链抗体基因转入真核表达载体,进行真核瞬时表达,通过细胞试验进一步验证其中和活性。方法:将1AscFv抗体基因克隆到真核表达载体pIgG中(编码全长人源性IgG1类抗体),T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑... 详细信息

目的:将一株人源性中和性抗bFGF单链抗体基因转入真核表达载体,进行真核瞬时表达,通过细胞试验进一步验证其中和活性。方法:将1AscFv抗体基因克隆到真核表达载体pIgG中(编码全长人源性IgG1类抗体),T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑取4个克隆,经测序其中有一株含有正确的scFv序列,命名为pIgG-1A2,将pIgG-1A2转染真核细胞HEK293T进行瞬时表达,表达产物经蛋白G纯化后,SDS-PAGE检测纯化抗体的纯度;ELISA和Western blot检测抗体的特异性;MTT法检测纯化抗体对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人神经胶质瘤细胞株U87MG增殖的影响。结果:经酶切鉴定和测序发现pIgG-1A2含有正确的抗体轻重链基因,经293T细胞瞬时表达,表达产物经蛋白G亲和层析柱纯化后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为95%的电泳纯抗体,产量可以达到每升细胞培养上清10mg,交叉反应显示表达的抗体特异性针对bFGF,体外实验证实1A2能够抑制bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的增殖,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖。结论:通过真核细胞成功地表达了抗bFGF人源性抗体,纯化后获得了高纯度的抗体,对HUVEC和神经胶质瘤细胞株U87MG具有抑制作用,为抗bFGF人源性抗体抗肿瘤研究奠定基础。

关键词： bFGF 人源性抗体瞬时表达中和活性

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人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

中华微生物学和免疫学杂志 2010年第7期30卷 674-677页

作者：王宏陶俊邓宁周丽君向军俭暨南大学生命科学技术学院抗体工程中心广州510632 南方医科大学基础医学院免疫教研室解放军海军总医院中心实验科

目的用重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体（scFv）.方法用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选... 详细信息

目的用重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体（scFv）.方法用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.

关键词：噬菌体展示抗体库 bFGF 人源性抗体单链抗体

人源性抗bFGF抗体抑制人黑色素瘤生长的作用研究

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免疫学杂志 2013年第7期29卷 578-582页

作者：杜超超亢中奎陈文慧潘磊宋其芳王宏黄建芳邓宁暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

目的研究人源性抗bFGF抗体对人黑色素瘤A375细胞的体内外增殖抑制作用。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞,CCK-8法检测人源性抗bFGF抗体对A375细胞增殖的影响;Western blot检测人源性抗bFGF抗体对bFGF下游信号通路中ERK1/2磷酸化的影响;... 详细信息

目的研究人源性抗bFGF抗体对人黑色素瘤A375细胞的体内外增殖抑制作用。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞,CCK-8法检测人源性抗bFGF抗体对A375细胞增殖的影响;Western blot检测人源性抗bFGF抗体对bFGF下游信号通路中ERK1/2磷酸化的影响;建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过记录各处理组裸鼠皮下移植瘤的体积、质量及裸鼠体质量变化,研究人源性抗bFGF抗体在体内对人黑色素瘤生长的抑制作用;免疫组化检测肿瘤组织内的微血管密度。结果 CCK-8实验结果表明人源性抗bFGF抗体能抑制A375细胞的生长,在800 ng/ml的质量浓度下,抑制率为24%;Western blot结果表明人源性抗bFGF抗体显著抑制FGFR下游信号通路中ERK1/2的磷酸化;裸鼠体内试验中,人源性抗体明显抑制了肿瘤的生长,抑制率为28.12%。免疫组化结果显示各组肿瘤组织中微血管密度均有下降。结论该株人源性抗体在体外可有效的抑制人黑色素瘤细胞的生长,并能在体内抑制肿瘤生长及血管新生。

关键词：黑色素瘤碱性成纤维细胞生长因子人源性抗体

人源性噬菌体抗体库的构建及抗肺癌抗体基因的筛选、表达和核苷酸序列分析

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第三军医大学学报 1998年第1期20卷 55-55,59页

作者：胡建林郭先健胡义德黄桂君李淑平陈维中第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所

人源性噬菌体抗体库的构建及抗肺癌抗体基因的筛选、表达和核苷酸序列分析Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＤＮＡｓｅｇｕｅｎｃｉ... 详细信息

人源性噬菌体抗体库的构建及抗肺癌抗体基因的筛选、表达和核苷酸序列分析Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＤＮＡｓｅｇｕｅｎｃｉｎｇｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａ...

关键词：噬菌体抗体人源性抗体肺肿瘤重组核苷酸序列分析

人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因在Sp2/0细胞中的初步表达

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细胞与分子免疫学杂志 2001年第5期17卷 475-476页

作者：吴兴安徐志凯阎岩张芳琳罗雯刘勇白文涛王海涛赵茜第四军医大学微生物学教研室陕西西安710032

目的在前期工作的基础上进一步将人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因转染到鼠骨髓瘤细胞Sp2/0并进行初步表达。方法将含人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因的真核表达载体VκEpSV-neo,用脂质体法转染鼠骨髓瘤细胞Sp2/0用RT-PCR法和免疫组化染色法... 详细信息

目的在前期工作的基础上进一步将人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因转染到鼠骨髓瘤细胞Sp2/0并进行初步表达。方法将含人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因的真核表达载体VκEpSV-neo,用脂质体法转染鼠骨髓瘤细胞Sp2/0用RT-PCR法和免疫组化染色法检测转染及表达结果。结果RT-PCR和免疫组化染色结果表明人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因不仅已成功地转染进Sp2/0细胞,并得到了良好的表达。结论在鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中成功表达人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因,对抗HFRS病毒抗体人源化的研究具有重要意义。

关键词：肾综合征出血热病毒人源性抗体轻链转染真核表达

人源性抗bFGF抗体抑制人黑色素瘤生长的作用研究

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人源性抗bFGF抗体抑制人黑色素瘤生长的作用研究

作者：杜超超暨南大学

学位级别：硕士

目的研究人源性抗bFGF抗体对人黑色素瘤A375细胞体内外增殖的抑制作用，并对其抑制机理进行初步探讨。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞，CCK-8法检测人源性抗bFGF抗体对A375细胞增殖的影响;Western Blot检测人源性抗bFGF抗... 详细信息

目的研究人源性抗bFGF抗体对人黑色素瘤A375细胞体内外增殖的抑制作用，并对其抑制机理进行初步探讨。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞，CCK-8法检测人源性抗bFGF抗体对A375细胞增殖的影响;Western Blot检测人源性抗bFGF抗体对bFGF下游信号通路中ERK1/2磷酸化的影响;建立裸鼠皮下移植瘤模型，并尾静脉注射人源性抗bFGF抗体，给药过程中记录裸鼠体重变化，皮下肿瘤长和宽，以研究人源性抗bFGF抗体在体内对人黑色素瘤生长的抑制作用;处死小鼠后剥离肿瘤块儿，拍照称重，并用免疫组化检测肿瘤组织内的微血管密度。结果体外增殖抑制实验结果表明人源性抗bFGF抗体能抑制A375细胞的生长，在800ng/mL的浓度下，抑制率约为24%;经Western Blot验证，人源性抗bFGF抗体抑制FGFR下游信号通路中ERK1/2的磷酸化;裸鼠体重统计结果显示，除了环磷酰胺组的裸鼠体重下降之外，其他三组裸鼠体重均上升，说明该株人源性抗体是安全的;裸鼠皮下移植瘤测量结果显示，与PBS对照组相比，人源性抗体组、鼠源抗体组、环磷酰胺组的抑制率分别为28.12%，37.34%，40.78%;免疫组化结果显示各组肿瘤组织中微血管密度均有下降。结论该株人源性抗体在体外可有效的抑制人黑色素瘤细胞的生长，并能在体内抑制肿瘤生长及血管新生。

关键词： bFGF 人源性抗体黑色素瘤

同方学位论文库评论

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人源性治疗性抗体技术平台

生物产业技术 2009年第1期 54-56页

作者：王双俞炜源孙志伟军事医学科学院生物工程研究所北京100071

治疗性抗体具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。治疗性抗体产业已经成为整个生物制药行业的支柱产业，其销售额连年大比例上升，2007年已达240亿美元（约合1648．56亿元人民币），占整个生物技术药物年销售总额的近1／3。目前，治疗... 详细信息

治疗性抗体具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。治疗性抗体产业已经成为整个生物制药行业的支柱产业，其销售额连年大比例上升，2007年已达240亿美元（约合1648．56亿元人民币），占整个生物技术药物年销售总额的近1／3。目前，治疗性抗体已经发展到人源性抗体阶段，尽管已上市的抗体仅有20％为人源性抗体，但是临床研究阶段的人源性抗体却已达到50％左右。

关键词：治疗性抗体技术平台生物技术药物人源性抗体支柱产业市场价值制药行业销售额

基因工程技术制备人源性抗48kD角蛋白抗体Fab片段

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基因工程技术制备人源性抗48kD角蛋白抗体Fab片段

针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源性抗体偶联药物研究

2001年中国中西医结合皮肤性病学术会议

作者：李承新刘玉峰李春英万业宏王刚第四军医大学西京医院皮肤科海军总医院皮肤科

目的用基因工程技术制备人源性抗角质蛋白抗体Fab片段,并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定。方法将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,产物经金属螯合层析... 详细信息

目的用基因工程技术制备人源性抗角质蛋白抗体Fab片段,并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定。方法将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,产物经金属螯合层析纯化,并用ELISA鉴定抗原综合活性特异性、SDS-PAGE中形成50KD单一条带,在还原SDS-PAGE中可见23、25KD两条带。ELISA和Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性。结论成功表达并鉴定了人源性抗48KD角蛋白的Fab可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值打下了良好的基础。

关键词：角蛋白人源性抗体 Fab 制备鉴定

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源性抗体偶联药物研究

作者：吴介恒第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景:前列腺癌是严重威胁男性健康的常见泌尿系肿瘤。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性地高表达于前列腺癌细胞表面,是理想的治疗靶分子。抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADC)由抗体、... 详细信息

研究背景:前列腺癌是严重威胁男性健康的常见泌尿系肿瘤。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性地高表达于前列腺癌细胞表面,是理想的治疗靶分子。抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADC)由抗体、化学药物及“连接肽”(Linker)共同构成,它能协同发挥抗体药物和化学药物各自的优点,实现对肿瘤细胞的特异性杀伤,是非常有前景的抗肿瘤药物。目的:构建抗PSMA人源性抗体PSMAb的真核表达载体,在真核细胞中进行表达并纯化后,检测其生物学活性;将该抗体与化学药物美登素(DM1)偶联制备出抗体偶联药物,并在体内外验证其功能。方法:将从酵母展示scFv抗体库中筛选获得的一株抗人PSMA单链抗体的轻、重链可变区基因分别与恒定区拼接,获得完整的抗体轻、重链基因,并对基因序列进行密码子优化,使其能够在CHO细胞中高表达,将优化后抗体轻、重链基因进行合成后分别克隆入真核表达载体pCDNA3,获得分别表达抗体轻、重链的表达载体,分别命名为pCDNA3-LC和pCDNA3-HC。将轻、重链表达质粒按照4:1的比例瞬时转染CHO-S细胞进行表达,收集培养上清,利用亲和层析柱进行纯化,获得抗PSMA的全抗体PSMAb。利用细胞ELISA、间接免疫荧光染色和流式细胞术检测PSMAb的亲和力、内化活性及其与PSMA阳性细胞的结合能力。将PSMAb与近红外染料IRDye 800 CW偶联后,注射给PSMA阳性和PSMA阴性荷瘤裸鼠,检测其在体内的分布情况。将PSMAb与微管抑制剂DM1进行偶联,制备出抗体偶联药物PSMAb-DM1,并在体内外验证其对PSMA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性。结果:经测序证实PSMAb抗体的轻重链基因序列均正确,酶切鉴定证实成功构建了PSMAb抗体轻、重链的真核表达载体。瞬时转染CHO-S细胞后可有效表达PSMAb,亲和层析纯化获得了纯度较高的PSMAb蛋白。细胞ELISA、流式细胞术、间接免疫荧光染色等实验证实PSMAb具有高亲和力,能特异性地与PSMA阳性细胞结合,且可有效内化入PSMA阳性细胞。体内检测发现,IRDye 800 CW标记的PSMAb可特异性地分布于PSMA阳性肿瘤组织。将PSMAb与DM1偶联后,流式细胞术证实DM1的偶联不影响PSMAb与PSMA阳性细胞的结合能力,间接免疫荧光染色证实PSMAb-DM1仍可有效内化入PSMA阳性细胞。在体外通过Alamar Blue实验和凋亡检测证实PSMAb-DM1可有效杀伤PSMA阳性细胞,且可诱导PSMA阳性细胞凋亡。计算得出PSMAb-DM1的IC50浓度为0.12n M。体内实验证实PSMAb-DM1可有效抑制PSMA阳性肿瘤的生长。结论:1)成功构建了抗PSMA人源性抗体PSMAb轻、重链的真核表达载体。2)瞬时转染CHO-S细胞后,利用亲和层析的方法获得了高纯度的PSMAb抗体。3)细胞ELISA、流式细胞术和间接免疫荧光染色证实PSMAb具有高亲和力,可特异性结合并有效内化入PSMA阳性肿瘤细胞。4)将PSMAb与DM1偶联后,成功制备出抗体偶联药物PSMAb-DM1。5)证实PSMAb-DM1可在体外特异性杀伤PSMA阳性肿瘤细胞,可在体内有效抑制PSMA阳性肿瘤的生长。

关键词： PSMA 人源性抗体抗体偶联药物前列腺癌肿瘤靶向治疗