应用荧光原位杂交技术构建日本血吸虫基因组物理图谱草图

作     者：莫筱瑾 

作者单位：中国疾病预防控制中心 

学位级别：硕士

导师姓名：胡薇

授予年度：2011年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：日本血吸虫 荧光原位杂交 细菌人工染色体 C带 基因组物理图谱 中期染色体 序列分析 

摘      要：[目的]应用荧光原位杂交技术构建日本血吸虫基因组物理图谱草图,明确日本血吸虫BAC克隆在日本血吸虫染色体上的定位,获取更多相关信息,探寻定位在性染色体上的BAC克隆,为新的潜在药物和候选疫苗靶点提供线索,为日本血吸虫精细测序提供基础,为改善现有日本血吸虫药物靶点和疫苗研究现况提供帮助。 [方法]从日本血吸虫细菌人工染色体克隆文库中,随机挑选100个细菌人工染色体单克隆,抽提获得这100个细菌人工染色体克隆DNA。以安徽贵池阳性钉螺为原料,制备获得日本血吸虫中期染色体玻片。采用C显带方法识别日本血吸虫8对染色体,并计算20个日本血吸虫染色体分裂相中所有染色体的相对长度和臂比值。采用荧光原位杂交方法或双色荧光原位杂交方法,将随机挑选的100个日本血吸虫BAC克隆DNA标记生物素或地高辛作为探针,先与日本血吸虫中期染色体进行杂交,后与FITC-亲和素或罗丹明-抗地高辛抗体结合,最后经DAPI荧光染料复染,观察BAC克隆在日本血吸虫中期染色体上的定位。采用双色荧光原位杂交方法,将分属于9个重叠群支架（supercontig）的20个BAC克隆定位在日本血吸虫染色体上。选择9个经全序列测序的BAC克隆,用生物学信息分析软件进行基因预测和基因注释分析。 [结果]抽提获得随机挑选的100个BAC克隆DNA,并预测BAC克隆大小主要集中在75kb-140kb之间。以日本血吸虫阳性钉螺为原料,制备获得300张日本血吸虫中期染色体玻片。计算日本血吸虫染色体臂比值,得到日本血吸虫核型公式为：2n=6m+6st+4sm（ZZ）和2n=5m+6st+5sm（ZW）。日本血吸虫染色体经C带分析,获得日本血吸虫8对染色体C带模式图。采用荧光原位杂交技术或双色荧光原位杂交技术将随机挑选的100个BAC克隆中的97个BAC克隆分别定位在日本血吸虫7对常染色体和1对性染色体上,其中有22个定位在1号染色体;各有14个定位在2号和3号染色体;有9个定位在4号染色体;各有3个定位在5号、6号和7号染色体;有38个定位在2条性染色体。应用双色荧光原位杂交技术验证并非所有属于同一个supercontig的BAC克隆都定位在相同染色体的同一部位。预测9个经全长测序的BAC克隆所含的基因和其功能,并选择蛋白长度大于90个氨基酸的序列进行翻译,发现每个BAC克隆包含12-25个不等的蛋白序列。 [结论]采用荧光原位杂交和双色荧光原位杂交技术,首次构建日本血吸虫基因组物理图谱。日本血吸虫有7对常染色体和1对性染色体,按染色体大小,将这8对染色体分为3组：第一组为1号染色体和性染色体;第二组为2号、3号和4号染色体;第三组为5号、6号和7号染色体。按染色体臂比值计算结果,获得日本血吸虫染色体核型公式为2n=6m+6st+4smm（ZZ）和2n=5m+6st+5sm（ZW）,初步认为日本血吸虫性染色体Z属于中部着丝粒染色体,W属于亚中部着丝粒染色体,不属于亚端部着丝粒染色体,与曼氏血吸虫性染色体不同。明确从基因组文库中随机挑选的97个BAC克隆在日本血吸虫8对染色体上的定位,其中有38个BAC克隆定位在日本血吸虫性染色体,这些BAC克隆的序列信息可为今后寻找新的潜在的药物靶点和疫苗靶点提供线索。对于前期基因组草图研究中获得的supercontig,本研究应用双色荧光原位杂交技术验证并非所有同属于一个supercontig的BAC克隆都定位在同一个染色体的相同或相近部位,说明日本血吸虫基因组草图拼装方法有待改进。用生物学信息软件分析了9个BAC克隆序列,并预测每个BAC克隆包含12-25个不等的蛋白序列及其功能,为将来目的基因信息挖掘提供帮助。