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日本血吸虫单性感染雄虫和双性感染雄虫差异表达蛋白的筛选与鉴定

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生物化学与生物物理进展 2007年第3期34卷 283-291页

作者：戴橄汪世平余俊龙徐绍锐彭先楚刘雪琴周松华刘芬中南大学湘雅医学院血吸虫病研究室长沙410078

采用双向凝胶电泳和质谱技术对日本血吸虫单性感染雄虫和双性感染雄虫蛋白质表达谱进行分析,并在mRNA水平进行验证;观察差异表达SJCHGC蛋白重组真核表达质粒pEGFP-C1/SJCHGC在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位,并分析其表达产物的抗原性.... 详细信息

采用双向凝胶电泳和质谱技术对日本血吸虫单性感染雄虫和双性感染雄虫蛋白质表达谱进行分析,并在mRNA水平进行验证;观察差异表达SJCHGC蛋白重组真核表达质粒pEGFP-C1/SJCHGC在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位,并分析其表达产物的抗原性.成功鉴定了9个日本血吸虫雌雄合抱差异表达蛋白,其中在日本血吸虫雄虫合抱前表达上调的蛋白质有6个;而有3个蛋白质在日本血吸虫雄虫合抱后表达明显上调.大多数差异蛋白功能涉及血吸虫的生长发育、生殖、营养、运动、信号传递等过程.重组质粒pEGFP-C1/SJCHGC融合基因真核表达载体在真核细胞COS-7中获得了表达,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,细胞所表达的融合蛋白具有血吸虫抗原性.研究结果为揭示日本血吸虫雌雄合抱机制、研制抗血吸虫雌雄合抱疫苗提供了理论依据.

关键词：日本血吸虫雌雄合抱蛋白质组学双向电泳(2-DE) 基因克隆绿色荧光蛋白 COS-7细胞

日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第3期34卷 311-317页

作者：金亚美林矫矫冯新港张亮吴祥甫周元聪蔡幼民中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、农业部动物寄生虫学重点开放实验室

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段SjGcp1分别设计三对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出大小为 1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本... 详细信息

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段SjGcp1分别设计三对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出大小为 1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的完整阅读框 ,与SmGcp碱基一致性为 85 % ,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为 83.7%。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET2 8c(+)中 ,在大肠杆菌BL2 1中获得表达 ,融合表达产物分子量约为 80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测 ,在预测位置出现了明显的识别条带 ,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性

关键词：日本血吸虫抱雌沟蛋白基因克隆基因表达

日本血吸虫中国株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的克隆、表达及其免疫保护性研究(英文)

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生物化学与生物物理进展 2006年第7期33卷 665-672页

作者：余俊龙汪世平何卓戴橄李文凯姜孝新曾少华肖小芹徐绍锐吕志跃彭先楚周松华刘雪琴中南大学湘雅医学院血吸虫病研究室长沙410078

根据基因库中日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)EST(BU803192)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjHGPRT基因不完整的3′端和5′端进... 详细信息

根据基因库中日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)EST(BU803192)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjHGPRT基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接,获得SjHGPRT全长cDNA(1270bp),经序列分析,推断该片段含有编码SjHGPRT基因的完整阅读框,其编码基因与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(SmHGPRT)全长编码基因碱基一致性为82%,其理论推导的氨基酸组成与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的一致性约为83%.将其编码基因克隆到表达载体pQE30上,在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达,表达产物分子质量约为28ku.用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行蛋白质印迹检测,在预测位置上出现明显的识别条带.重组蛋白动物免疫保护性结果显示:在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和雌子宫内卵数方面,疫苗组与对照组比较差异均具有显著性(P日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(SjHGPRT)全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达,表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果,是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗血吸虫病疫苗候选分子.

关键词：日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因克隆基因表达

日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Th1/Th2细胞因子水平的动态变化

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复旦学报（医学版） 2001年第1期28卷 39-41,46页

作者：夏超明龚唯骆伟周卫芳李允鹤查锡良熊思东苏州大学基础医学部寄生虫学教研室苏州215007 复旦大学基础医学院上海200032

目的　观察小鼠感染日本血吸虫后急、慢性期肝肉芽肿病变与Th1/Th2细胞因子的动态变化 ,探讨Th1/Th2在肉芽肿形成及调节中的作用。方法　采用石蜡切片 ,HE染色后观察感染小鼠肉芽肿病变 ,用ELISA双抗夹心法测定小鼠感染后 0、4、6、8和... 详细信息

目的　观察小鼠感染日本血吸虫后急、慢性期肝肉芽肿病变与Th1/Th2细胞因子的动态变化 ,探讨Th1/Th2在肉芽肿形成及调节中的作用。方法　采用石蜡切片 ,HE染色后观察感染小鼠肉芽肿病变 ,用ELISA双抗夹心法测定小鼠感染后 0、4、6、8和 12周血清及脾淋巴细胞IL 2、IFNγ 和IL 4水平的动态变化。结果　小鼠感染后 6周出现明显肝肉芽肿病变 ,8周肉芽肿反应达高峰 ;12周则明显缩小 ;感染小鼠血清及脾淋巴细胞的Th1细胞因子IL 2和IFNγ 在感染后 4～ 6周开始上升 ,8周达高峰 ,随后下降 ;而Th2细胞因子IL 4在感染后 8周时迅速上升且随感染时间延长而明显升高。结论　Th1细胞因子IL 2和IFNγ 与血吸虫卵肉芽肿的诱导和形成密切相关 ,而Th2细胞因子IL 4可抑制Th1细胞因子在血吸虫病慢性期虫卵肉芽肿自发性免疫调节中起重要作用。

关键词：日本血吸虫肝肉芽肿病变 Th1/Th2细胞因子小鼠

日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用

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生物化学与生物物理进展 2008年第8期35卷 921-928页

作者：何卓汪世平肖小芹曾少华刘明社李林周帅锋中南大学湘雅医学院寄生虫学系长沙410078 湖南师范大学第三附属医院长沙410006 山西省长治医学院寄生虫学教研室长治046000

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28k... 详细信息

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白***26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础.

关键词：日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 噬菌体展示抗体库 cDNA文库

日本血吸虫新抗原基因的筛选、克隆、表达和免疫效果研究

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生物化学与生物物理进展 2005年第4期32卷 331-337页

作者：陈利玉易新元曾宪芳蔡春 L.McREYNOLDS 中南大学湘雅医学院病原生物学系 Molecular Parasitology Group New England BiolabsMA01915USA

为了寻找日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj) 新的疫苗候选基因并进行免疫效果研究,用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的新基因(命名为Sj-F1,GenBank登录号为AY261995) 克隆入原核表达载体pTWIN1和... 详细信息

为了寻找日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj) 新的疫苗候选基因并进行免疫效果研究,用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的新基因(命名为Sj-F1,GenBank登录号为AY261995) 克隆入原核表达载体pTWIN1和真核表达载体pcDNA3,经PCR、限制性酶切筛选和鉴定阳性重组子. 将pTWIN1/Sj-F1质粒转化大肠杆菌ER2566,在低温和低IPTG浓度下诱导表达可溶性重组融合蛋白(rSj-F1/intein2),并经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)分析鉴定. 将pcDNA3/Sj-F1质粒转化大肠杆菌ER2502,大量制备DNA疫苗. 用重组融合蛋白和DNA疫苗免疫小鼠,末次免疫后2周用Sj尾蚴进行攻击感染. 感染后42天剖杀冲虫,计算减虫率和减卵率. 感染前采血用ELISA法检测抗体. 免疫保护效果测定显示:重组蛋白疫苗以FCA作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经粘膜免疫分别获得了28.07%、24.69%的减虫率和48.30%、46.38%的减卵率;DNA疫苗(pcDNA3/Sj-F1)单独免疫获得了18.47%的减虫率和35.06%的减卵率;用DNA疫苗启动免疫后用重组蛋白疫苗经皮下加强免疫,减虫率和减卵率分别提高到了40.42%和56.17%;用DNA疫苗启动免疫后用重组蛋白疫苗经黏膜加强免疫,减虫率和减卵率增高更明显,分别提高到了42.38%和62.

关键词：日本血吸虫免疫筛选雌虫 Sj-F1 免疫

日本血吸虫新抗原基因Sj-Ts4的克隆、表达及免疫保护性(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第2期34卷 143-148页

作者：周东明,易新元,曾宪芳,王敏,蔡春,王庆林,张顺科,MCREYNOLDS Larry 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 Molecular Parasitology G

为探讨旋毛虫感染小鼠后抗血吸虫感染的分子机制 ,并为血吸虫病疫苗的研究提供新的抗原分子 ,用旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库。经过 3轮筛选 ,获得 9个阳性克隆 ,其中新基因Sj Ts4有一完整的编码框 ,编码2 10个氨基酸。... 详细信息

为探讨旋毛虫感染小鼠后抗血吸虫感染的分子机制 ,并为血吸虫病疫苗的研究提供新的抗原分子 ,用旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库。经过 3轮筛选 ,获得 9个阳性克隆 ,其中新基因Sj Ts4有一完整的编码框 ,编码2 10个氨基酸。该蛋白质的理论分子量为 2 3kD ,等电点为 7.72。将Sj Ts4亚克隆于原核表达载体 pGEX 5X 3,以GST融合蛋白的形式在E .coliDH5α中表达。Western印迹分析显示 ,重组Sj Ts4蛋白 (rSj Ts4)能被慢性感染鼠血清识别。rSj Ts4或与弗氏完全佐剂混合后免疫小鼠 ,均可以诱导产生特异性的IgG抗体 ,抗体效价可高达 1∶2 5 6 0 0。两免疫组的减虫率分别为31.36 %和 36 .80 % ,与对照组相比都具有统计学意义

关键词：日本血吸虫旋毛虫 Sj-Ts4 分子克隆免疫

日本血吸虫中国大陆株肌动蛋白编码基因的克隆和表达

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生物化学与生物物理学报 2000年第5期32卷 545-549页

作者：朱建国林矫矫冯新港吴祥甫周元聪蔡幼民中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室!上海200232 中国科学院上海生物化学研究所上海200031中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室!上海200232中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫

根据曼氏血吸虫肌动蛋白基因SmAct2设计一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出一大小为 1131bp的基因片段。测序后分析序列推断该片段为编码肌动蛋白基因的完整阅读框基因 ,与SmAct2碱基同源性为 92 %。将... 详细信息

根据曼氏血吸虫肌动蛋白基因SmAct2设计一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出一大小为 1131bp的基因片段。测序后分析序列推断该片段为编码肌动蛋白基因的完整阅读框基因 ,与SmAct2碱基同源性为 92 %。将其克隆到表达载体 pET2 8a(+)中 ,在大肠杆菌BL2 1中获得了较高量的表达 ,融合表达产物分子量约为 47kD。利用日本血吸虫成虫粗抗原免疫大白兔所得抗血清对该表达产物进行Western印迹检测 ,在预测位置出现了明显的识别条带 ,说明所克隆的基因为编码日本血吸虫中国大陆株肌动蛋白基因。

关键词：日本血吸虫肌动蛋白基因克隆基因表达

日本血吸虫虫卵SjE16、SjPPIase和SjRobl基因的真核表达及其在诊断中的应用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第3期31卷 170-175页

作者：陈清吴琛耘冯艳吴健桦姚馨萦徐大刚王兆军上海交通大学医学院病原生物学教研室上海200025

目的真核表达日本血吸虫虫卵蛋白,并评价其在血吸虫病免疫学诊断中的作用。方法提取日本血吸虫虫卵RNA,逆转录后获得cDNA。PCR扩增日本血吸虫虫卵特异性或高表达基因SJCHGC01695(SjE16)、SJCHGC00856(SjIMA8)、SJCHGC06249(SjTOR)、SJCH... 详细信息

目的真核表达日本血吸虫虫卵蛋白,并评价其在血吸虫病免疫学诊断中的作用。方法提取日本血吸虫虫卵RNA,逆转录后获得cDNA。PCR扩增日本血吸虫虫卵特异性或高表达基因SJCHGC01695(SjE16)、SJCHGC00856(SjIMA8)、SJCHGC06249(SjTOR)、SJCHGC06324(SjP40)、SJEFTD02(SjSLP)、SJCHGC06679(SjP-PIase)和SJCHGC06529(SjRobl),亚克隆至真核表达载体pPIC9K。重组质粒电转至毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导目的蛋白表达。镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化获取重组蛋白后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对其进行分析鉴定。以血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)、重组蛋白SjE16、SjPPIase和SjRobl单用,3个重组蛋白两两伍用,及全部伍用作为包被抗原,ELISA法检测血吸虫感染小鼠血清、急性血吸虫病和慢性血吸虫病患者血清中相应抗体的反应性。结果PCR扩增获得7个日本血吸虫虫卵高表达基因,经酵母重组表达和Ni-NTA亲和层析纯化后成功获得3个重组蛋白SjE16、SjPPIase和SjRobl。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果显示,所获得的重组蛋白为目的蛋白。ELISA检测结果显示,血吸虫感染小鼠血清和血吸虫病患者血清中均可检测出被SjE16、SjPPIase和SjRobl识别的特异性IgM和IgG抗体。在急性血吸虫病患者中上述3种抗原IgM的检出率分别为80%、60%和80%,IgG检出率分别为40%、80%和70%。伍用组中,SjE16和SjRobl伍用抗原,检测急性血吸虫病患者血清中IgM抗体的敏感性为100%,高于其单独为抗原的敏感性。结论获得的3个日本血吸虫虫卵蛋白(SjE16、SjPPIase和SjRobl)均具有血吸虫病诊断的潜能,其中SjE16和SjRobl伍用抗原可提高急性血吸虫病诊断敏感性。

关键词：日本血吸虫虫卵高表达基因真核表达免疫学诊断