PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

作     者：段新平 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赖良学

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：piRNA PIWIL1 Cre/LoxP重组系统 转基因猪 

摘      要：非编码小RNA （non-coding RNA, ncRNA），主要包括siRNA （smallinterfering RNA）、miRNA（microRNA）和piRNA （PIWI-interacting RNA）三类，其中piRNA是科学家们持续关注的热点研究区域。2006年，piRNA被发现于动物（果蝇、小鼠、大鼠、人等）生殖细胞中，它是一类内源的新小分子非编码RNA。piRNA基因在整个基因组上几乎都有分布，但高度不连续，其长度集中在26～32nt，因其特异地与PIWI家族蛋白结合作用，所以piRNA才被称为PIWI-interacting RNA[1-4]。piRNA基因簇则主要分布于转座子、重复序列等区域，在染色体上的位置具有物种间保守性。piRNA主要表达于生殖细胞系，代表了一个独特小RNA通路，它能使生殖细胞转座子沉默。可能通过表观遗传调控及转录后调控等方式，参与生殖干细胞的自我维持和分化命运决定、减数分裂、精子形成等生殖相关过程。对维持生殖系DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用[5-7]。 Argonaute（AGO）蛋白家族主要分为两大亚家族，即类似于植物拟南芥Argonautel的AGO蛋白亚家族和类似果蝇PIWI的PIWI蛋白亚家族。人类AGO蛋白家族由8名成员组成，通过序列比较，它们分别是eIF2C/AGO亚家族的4个成员（EIF2C1/hAGO1，EIF2C2/hAGO2，EIF2C3/hAGO3和EIF2C4/hAGO4），以及PIWI亚家族的4个成员（PIWIL1/HIWI，PIWIL2/HILI，PIWIL3和PIWIL4/HIWI2）[8]。eIF2C/AGO亚家族的4个成员在成人各个组织中包括睾丸、心脏、肾、胸腺等都有表达，而PIWI亚家族的4个成员主要在睾丸的精原细胞或精母细胞中表达。AGO蛋白亚族和PIWI蛋白亚族均能与非编码小RNA结合，在转录、转录后甚至翻译水平上对靶基因及蛋白的调节发挥关键作用[9-10]。Argonaute蛋白家族是RNA沉默途径的关键因子[11]，而PIWI成员则伴随着piRNA的生物发生和生物学功能行使等一系列过程[5]，包括参与沉默转录基因过程、维持生殖系和干细胞功能以及调节翻译和mRNA的稳定性等。 虽然科学家们已经对于piRNA展开非常广泛的研究，并且已经取得了阶段性的成果，但仍然存在许多问题亟待我们进一步探索，如piRNA和PIWI蛋白相互作用的机制及调控作用等。有研究报道，在非生殖器官中PIWI蛋白也有高表达，提示piRNA在配子发育的过程中起重要作用外，在其他组织中可能也具有重要的调控作用。 本实验的目的是建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪，为后续在猪体内实现时空特异性缺失PIWI家族蛋白同一时空表达的基因，为研究piRNA的功能、揭示piRNA与PIWI蛋白的相互作用机制提供可靠的动物平台奠定基础。 本实验以上述研究成果为背景，将PIWIL1启动子连接于猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor上，获得PIWIL1特异性启动Cre重组酶表达的pPIWIL1-Cre载体。转染小型猪胎儿成纤维细胞，药物筛选获得细胞阳性克隆后进行核移植和胚胎移植，最终获得PIWIL1特异性表达Cre重组酶的转基因猪，为研究piRNA的功能、揭示PIWI与PIWI蛋白的相互作用机制提供可靠的动物平台奠定基础。