基于DNA条形码技术的重楼正伪品鉴定方法研究

作     者：姜黎 

作者单位：泸州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：孙琴

授予年度：2013年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：重楼 鉴别 DNA条形码 筛选 matK trnL-trnF rpoC1 ITS 

摘      要：目的：对4条不同的单序列片段(matK、trnL-trnF、rpoC1、ITS)及其两序列组合片段和三序列组合片段,在重楼正品与其常见近缘种的鉴别方面进行了研究,筛选出良好可靠的DNA条形码或组合,进而对市场上常见的重楼饮片进行鉴别,为寻找正品重楼的替代品种,缓解市场供求压力提供参考。同时为利用DNA条形码鉴定重楼及其混伪品方面的研究提供方法的参考。 方法：使用叶绿体trnL-trnF、matK、rpoC1序列和核ITS序列的通用引物,对1份重楼对照药材和采自云南、四川的8个重楼近缘种(共26份样品)及市场购买的10个饮片、伪品拳参、白附子(共3份样品)进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增效率和测序成功率;Clustal软件对所得序列进行多重序列比对,MEGA5.0软件裁齐后,结合PAUP4.0B10软件计算GC含量、保守位点、变异位点、信息位点;Taxon DNA软件统计种间种内遗传距离的分布频度,进行barcoding gap分析,结合Wilconxon秩和检验比较不同片段之间种内种间差异,筛选出理想的序列及序列组合;通过构建系统发育树(MP树)分析评价筛选出的序列及序列组合对正品重楼及近缘种药材和饮片的鉴定效果。 结果：(1)ITS、matK、rpoC1、trnL-trnF序列片段的PCR扩增效率,ITS的扩增效率为98%,其次是rpoC1为93%,trnL-trnF为91%,matK的扩增效率为87%;ITS测序成功率达到了97%,rpoC1、trnL-trnF序列的测序成功率为96.7%、95%,matK序列的测序成功率为达83.6%。(2)barcoding gap分析显示,在单序列片段中,ITS的种内遗传变异分布在数值较小的一侧(左侧),种间变异分布在数值较大的一侧(右侧),种内与种间的间隔区较其他序列片段更明显,其gap位置在4%-5%之间,其次是trnL-trnF序列,其gap位置在2%-3%之间,matK、rpoC1序列的种内与种间重叠较多,没有明显的gap区。在两片段组合序列中,ITS+trnF-trnL的gap区较其他组合序列好,且barcoding gap图效果优于这两个单片段。三片段组合序列的barcoding gap图并没有在两片段组合的基础上有明显改变。(3) Wilcoxon秩和检验表明,单序列片段中,ITS种间变异都大于其他序列,且P0.01,其差异具有显著性,其次是trnF-trnL。种内变异matK最大;两序列组合片段中,ITS+trnF-trnL的种间变异性大于其他组合序列,种内变异性小于其他组合序列。三序列组合片段的种内种间差异均较低。(4)基于ITS、ITS+trnL-trnF构建的系统树中,采自四川和云南的同一个种都单独聚为一支,地域差异不明显;多叶重楼与七叶一枝花聚为一小支,毛重楼与云南重楼聚为一支,提示多叶重楼、毛重楼与正品重楼有较近的亲缘关系;市购的10个饮片样本中,饮片3与七叶一枝花首先聚在一起,提示其与七叶一枝花有较近的亲缘关系,而饮片4与云南重楼亲缘关系较近,饮片1、5、7与花叶重楼的亲缘关系较近,饮片10与球药隔重楼的亲缘关系近,饮片8、9与毛重楼有较近的亲缘关系,饮片2、6与拳参一起聚在重楼属物种的外围,据此可鉴别饮片2、6是伪品。 结论：ITS序列作为DNA条形码候选序列,能够鉴定重楼与其常见近缘种及饮片,同时我们推荐ITS+trnL-trnF组合序列作为其补充序列。