化学辅助去核方法对牛卵母细胞MAPK活性及母源基因c-mos表达水平的影响

作     者：任久生 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张嘉保

授予年度：2013年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：牛卵母细胞 化学辅助去核方法 秋水仙素 MAPK c-mos 

摘      要：自从1997年克隆羊多莉成功诞生以来，体细胞核移植技术、转基因技术以及干细胞治疗一直是研究的热点。尽管不断有克隆动物诞生，但克隆成功率仍处于较低水平。克隆是个相对复杂的过程且有多种因素可以影响克隆效率，其中包括不同供体细胞类型、不同的去核方法、不同的激活方法和不同类型培养基等。其中不同的去核方法对克隆效率有直接影响，化学辅助去核方法与其他去核方法比较有去核准确、吸出胞质量少和细胞毒性小的优点，因此化学辅助去核方法在大动物去核上有广泛应用，但具体分子作用机制研究甚少。 为了阐明秋水仙素引起卵母细胞的同源染色质凝集形成细胞膜突起的分子机制。本实验探讨了在基础培养基添加中PVA、L-cysteine和不同浓度FSH对牛卵母细胞成熟率的影响并对CB+离子霉素、6-DMAP+离子霉素、CB+6-DMAP+离子霉素化学激活和电激活的卵裂率和囊胚率进行比较。探讨了秋水仙素不同处理浓度、不同处理时间及和蔗糖共同处理对牛卵母细胞细胞膜突起率的影响。然后，利用Western-blot、实时荧光定量PCR和免疫荧光，重点探讨了秋水仙素处理对牛卵母细胞中促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)活性及其上游调控基因c-mos表达水平的影响，以及在这一过程中纺锤体和细胞核的位置在牛卵母细胞中的变化。 研究结果表明，在培养基中添加FSH可以显著提高牛卵母细胞成熟率，添加L-cysteine能够抑制牛卵母细胞的成熟，在TCM199+10%FBS+50μg/mlFSH+2.2μg/mlpyruvate+1μg/ml17β-estradio+1%penicillin streptomycin的培养基中牛卵母细胞成熟率最高达95.92%。通过对牛卵母细胞不同孤雌激活方法进行比较发现，CB+6-DMAP+离子霉素化学激活效果最佳，卵裂率和囊胚率分别为90.59%和21.17%（P0.05）。同时，对秋水仙素处理牛卵母细胞的不同浓度和时间比较分析表明，秋水仙素的最适处理浓度为0.6μg/ml，最佳处理时间为1h，秋水仙素和蔗糖共同处理可以提高牛卵母细胞细胞膜突起率。Western-blot结果表明经秋水仙素处理的牛卵母细胞中MAPK的活性升高，并且实时荧光定量PCR结果表明秋水仙素能够上调母源基因c-mos的表达水平，经免疫荧光观察发现纺锤体和细胞核位置位于细胞膜突起处。 综上所述，本研究优化了牛卵母细胞的体外培养体系和秋水仙素的处理条件。不仅证明了秋水仙素和蔗糖同时处理可以提高牛卵母细胞细胞膜突起率，而且证明了秋水仙素上调母源基因c-mos的表达水平，并能够使MAPK活性升高。而且在这一过程中，纺锤体和细胞核的位置发生了改变。说明秋水仙素引起卵母细胞膜的突起的原因可能是通过调控母源基因c-mos表达水平，继而影响MAPK的活性，从而导致卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的形态及组装发生改变。研究结果为阐明化学辅助去核方法的分子机制提供了理论基础。