自噬抑制剂3-MA增强内质网应激诱导的人鼻咽癌细胞的凋亡

作     者：宋乐乐 

作者单位：蚌埠医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张旭东;刘浩

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：鼻咽癌 顺铂 电离辐射 内质网应激 自噬 GRP78 beclin1 LC3 2-脱氧-D-葡萄糖 衣霉素 3-甲基腺嘌呤 

摘      要：目的： 1.观察顺铂(cisplatin，DDP)或电离辐射(ionizing radiation，IR)对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用，以及DDP、IR能否诱导人鼻咽癌细胞产生内质网应激、自噬。 2.观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用，以及对人鼻咽癌细胞放化疗的增殖抑制及诱导凋亡作用和自噬相关蛋白表达的影响。 3.观察内质网应激诱导剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)、衣霉素(tunicamycin，TM)对人鼻咽癌细胞增殖抑制的影响，以及自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM诱导的人鼻咽癌细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响。 方法： 1. MTT法检测DDP(0.06、0.60、6.00、60.0、600μmol·L)、IR(2、4、6、8、10Gy)处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224、36、48h后对细胞存活率的影响;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测DDP(6.00μmol·L)、IR(4Gy)对人鼻咽癌细胞诱导凋亡的作用;Western blotting法检测DDP(6.00μmol·L)、IR(4Gy)处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-26、16、24h后对人鼻咽癌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响。 2. MTT法检测自噬抑制剂3-MA(0.625、1.25、2.5、5、10mmol·L)对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2存活率的影响;采用MTT法和集落克隆形成法检测了自噬抑制剂3-MA对DDP、IR刺激人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影响;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色荧光显微镜观察自噬抑制剂3-MA(1mmol·L)对DDP(6.00μmol·L)、IR(4Gy)诱导的人鼻咽癌细胞凋亡的影响;同上处理，Western blotting法检测自噬抑制剂3-MA对DDP、IR诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响;Immunocytochemistry法检测自噬抑制剂3-MA对DDP、IR诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1表达的影响。 3. MTT法检测内质网应激诱导剂2-DG(1.25、2.5、5、10、20mmol·L)、TM(2、 4、8、16、32μmol·L)对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2存活率的影响;采用MTT法和集落克隆形成法检测了自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM刺激人鼻咽癌细胞增殖抑制作用的影响;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色荧光显微镜检测自噬抑制剂3-MA对2-DG(5mmol·L)、TM(1μmol·L)诱导的人鼻咽癌细胞凋亡的影响;同上处理，Western blotting法检测自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM刺激的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响;Immunocytochemistry法荧光显微镜检测自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1表达的影响。 结果： 一、DDP、IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖及凋亡的影响 ***法结果显示不同浓度的DDP、不同剂量的IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2均具有增殖抑制作用，且随着DDP浓度的增加和作用时间的延长，DDP对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增强，6.00μmol·LDDP作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的24、36、48h存活率分别为80.74%、79.95%、78.92%和82.15%、82.05%、79.13%;随着IR剂量的增加和作用时间的延长，IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用也逐渐增强，4Gy IR作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224、36、48h后细胞存活率分别为82.29%、73.51%、62.35%和92.35%、83.58%、72.37%。 2．6.00μmol·LDDP刺激人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224h后，诱导人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分别为5.8%和6.7%，与阴性对照组比较无统计学意义，4Gy IR作用24h诱导的人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分别为5.1%和5.4%，与阴性对照组比较无统计学意义。 3．经6.00μmol·L DDP、4Gy IR处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-26、16、24h后，人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2内质网应激反应的标志蛋白GRP78呈时间依赖性上调，自6h起逐渐升高，24h达到高峰。Western blotting法进一