艾烟冷凝物对肺泡II型上皮细胞A549的毒性研究

作     者：胡海 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邬继红

授予年度：2012年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：艾烟冷凝物 细胞形态 细胞活性 细胞凋亡 细胞周期 增殖作用 毒性作用 

摘      要：目的：本实验采用PM10切割头采集三年蕲艾燃烧所产生的人体可吸入的艾烟部分,制备成实验研究需要的艾烟冷凝物,观察不同浓度艾烟冷凝物对肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)形态、活性、凋亡以及周期的影响,从而得出艾烟冷凝物对体外培养细胞的毒性作用规律。 方法：通过预实验进行了艾烟冷凝物作用于A549细胞24h、48h半数致死浓度的摸索,结果为24h：IC50：0.235mg/ml;95%置信区间：0.208-0.257;48h：IC50：0.139mg/ml;95%置信区间：0.087-0.176,为本实验的研究内容提供浓度依据;基于24h半数致死浓度为最高染毒浓度设计24h细胞形态的观察的不同浓度(0.05mg/mL0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL),应用普通显微镜、荧光显微镜分别观察细胞形态变化;以不同高浓度艾烟冷凝物(0.06mg/mL、0.09mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL、0.24mg/mL、0.27mg/mL、0.3mg/mL)进行细胞染毒,染毒时间分别为12h、24h、36h、48h,采用MTT方法观察艾烟冷凝物对A549细胞活力的时间浓度效应,基于前期实验,设计不同低浓度艾烟冷凝物(0.01mg/mL、0.015mg/mL、0.02mg/mL、0.025mg/mL、0.03mg/mL、0.035mg/mL、0.04mg/mL、0.045mg/mL、0.05mg/mL)染毒48h,采用MTT方法观察细胞活力变化,从而得出艾烟冷凝物对细胞是否具有增殖作用;以不同浓度艾烟冷凝物(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL)进行细胞染毒24h,分别采用hoechest33258染色进行形态学定性观察和Annexin V-FITC/PI染色进行流式细胞仪定量检测;以不同浓度艾烟冷凝物(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL)进行细胞染毒24h,RNase A和PI染色后通过流式细胞仪测定A549细胞周期变化。 结果：两种显微镜下观察发现艾烟冷凝物在0.05mg/ml时细胞形态基本无变化,在高于0.05mg/ml时细胞形态逐渐由梭形、多角形变为圆形、细胞数量逐渐下降,具有明显的浓度依赖性。MTT法结果显示：艾烟冷凝物作用于细胞12h,结果0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.24mg/ml浓度的艾烟冷凝物对细胞存活率无明显影响(p0.05),0.12mg/ml浓度的艾烟冷凝物能够显著提高细胞存活率(p=0.0050.05),作用于36h、48h以及其他12h、24h浓度的细胞存活率显著降低(p0.05),与对照组相比,A549的细胞活性随浓度和时间发生改变,具有明显的时间浓度依赖性;不同浓度艾烟冷凝物作用于A549细胞48h,结果显示0.02mg/ml、0.025mg/ml浓度的艾烟冷凝物能够显著提高细胞存活率(p0.05)。荧光显微镜下观察发现艾烟冷凝物可以诱导细胞发生早起凋亡,且呈现浓度依赖性,当浓度达到0.25mg/ml时细胞更多的呈现出晚期凋亡、坏死的状态;流式细胞仪进行定量检测结果显示正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞呈现聚集性,且随着艾烟冷凝物浓度的增加聚集性增强,未能检测出细胞凋亡率。流式细胞仪测定不同浓度浓度艾烟冷凝物对细胞周期的影响,结果显示：低浓度0.05mg/ml艾烟冷凝物能够使G2/M期细胞比率显著减少(p=0.0230.05),同时能使G0/G1期细胞比率显著增加(p=0.0020.01);高浓度0.25mg/ml艾烟冷凝物能够使G2/M期细胞比率显著增加(p=0.0020.01),高浓度艾烟冷凝物0.2mg/ml、0.25mg/ml能使G0/G1期细胞比率显著减少(p0.05)。 结论：1.一定浓度的艾烟冷凝物对A549细胞具有一定的毒性作用;2.一定浓度的艾烟冷凝物对A549细胞具有一定的增殖作用。