转Gbve1基因拟南芥对黄萎菌的抗性和机制研究

作     者：李红娟 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：窦道龙

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：棉花黄萎病 拟南芥 Gbve1基因 RNA-seq技术 抗性机制 

摘      要：棉花黄萎病是全世界棉花生产上危害最重要的病害之一,目前尚无有效的药剂防治措施,被称为棉花的“癌症。目前该病害防控最为有效的方法是抗病育种,然而目前生产上最为多用的陆地棉还缺乏有效的抗病材料,制约了抗病育种的应用。通过定位和克隆抗病基因,研究它们对黄萎病的抗性及其抗性机制对防治黄萎病至关重要。最近,我们从海岛棉“Hai7124中克隆了番茄抗黄萎病Ve同源的类受体蛋白基因Gbve1,并通过基因沉默技术和转基因技术证明了Gbve1基因对落叶型和非落叶型的棉花黄萎菌都具有一定抗性;将该基因转化到拟南芥(Arabidopsis)后,发现拟南芥对黄萎病的抗性有了明显增强,表明Gbve1在物种间具有一定的保守性。 为了进一步研究Gbve1的抗性机制,本课题筛选了转基因阳性克隆,转Gbve1基因拟南芥和对照植株Co1-0移栽到培养介质中后,通过棉花黄萎菌分生孢子悬浮液灌根法接种,并对其进行发病统计,发现由于Gbve1基因的表达,拟南芥对棉花黄萎菌表现抗性增强,而且,对落叶型V991菌株的抗性差异明显大于非落叶型菌株BP2。 随后,我们对转Gbve1基因拟南芥进行了比较详尽的细胞学机制研究。在根部抗性测定中,采用孢子悬浮液蘸根接种法,并对接种后的样品进行染色,发现接种24h后,转基因拟南芥根部胼胝质积累增多,而对照植株中没有明显积累。接种48h,转基因拟南芥中有细胞死亡,对照植株中没有明显细胞死亡,大量侵染菌丝聚集。我们采用离体叶片叶背接种法接种两种拟南芥,发现接种24h,转基因植株叶片中胼胝质沉积明显显著多于对照植株Col-0;采用H202测试盒对接种各个时间段H202含量进行测定,发现48h,转基因拟南芥过氧化氢含量迅速上升,达到一个峰值,经过DAB染色,此时间段转基因拟南芥出现深褐色斑,而对照植株只是浅棕色班,说明此时,转基因拟南芥中过氧化氢含量多于对照植株。细胞程序性死亡是抗病反应的典型表现,通过对48h和72h的接种样品进行台盼蓝染色,发现48h细胞坏死不明显,而在72h,二者着色情况差异明显,转基因拟南芥叶片被染成很深的蓝色,随即对其进行显微观察,发现转基因植物出现细胞坏死,对照植株有大量侵染菌丝出现。本研究分析了转基因拟南芥的一系列基础防卫反应,初步揭示了棉花Gbve1基因可以通过增强拟南芥的胼胝质沉积、过氧化氢积累及细胞死亡等途径,提高对棉花黄萎菌的抗性。 为了更加深入认识Gbve1的作用机制,我们对转基因拟南芥进行了表达谱测序及分析。研究发现,Gbve1基因的转入及表达会引起拟南芥多个基因的表达差异性变化,其中1204个基因上调,543个基因下调。推测Gbve1基因进入植物机体内部以后,参与相关基因表达的调控,当有病菌侵入时,转基因植物会迅速识别,从而启动防卫反应。这一研究结果为Gbve1的抗病机制研究提供了新的思路。