损毁腹外侧视前核后抑制结节乳头体核γ-氨基丁酸重摄对大鼠睡眠—觉醒时相的影响

作     者：张敏 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯一平

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071006[理学-神经生物学] 

主      题：睡眠觉醒时相 腹外侧视前核 结节乳头体核 γ-氨基丁酸能神经元 组胺能神经元 GABA重摄抑制 损毁 免疫组织化学 

摘      要：背景与目的：γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric ***)是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,参与睡眠觉醒周期的转换和慢波睡眠的维持。下丘脑腹外侧视前核(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)内80%的神经元为GABA能,VLPO的GABA能神经元与下丘脑后部结节乳头体核(tuberomammillary mucleus,TMN)的组织胺(histamine,HA)能神经元间投射并相互作用被认为调控睡眠觉醒的转换。研究提示TMN也存在GABA能神经元,但是TMN的GABA能神经元在睡眠-觉醒周期中的作用目前尚不明确。本研究拟特异细胞损毁VLPO后长时间记录大鼠睡眠觉醒周期变化,确定VLPO GABA能神经元在睡眠觉醒周期中的作用。阻止VLPO向TMN的投射后局部抑制TMN内GABA重摄,观察对睡眠觉醒时相的影响,确定TMN内GABA能神经元在睡眠觉醒周期中的作用,分别运用组织学和免疫组织化学等方法揭示VLPO神经细胞和GABA能神经元丢失与睡眠觉醒时相变化的关系,GABA神经元与HA神经元在TMN的分布和形态特点。 方法：雄性成年SD大鼠随机分为4组：before lesion组(n=7),after lesion组(n=7),after lesion plus vehicle组(n=8),after lesion plus GABA uptake inhibitor组(n=8)。麻醉下在额顶骨的两侧分别植入4个EEG电极,在项肌植入3根EMG电极。24小时EEG与EMG记录和睡眠觉醒周期解析后微量注射鹅膏蕈氨酸(IA,10 nmol/0.5μl/side)于双侧VLPO行特异性细胞损毁。其中部分大鼠(after lesion组)连续记录睡眠觉醒周期22天,余大鼠分别在损毁后第8,10,12,14天(D8,D10,D12,D14)的10：00或22：00 h注射GABA重摄抑制剂哌啶甲酸(NPA.1mmol/0.5μl/side).或生理盐水于双侧TMN,观察昼(08：00-20：00 h)和夜(20：00-08：00h)各12小时睡眠觉醒时相的变化,EEG快速傅里叶转换(fast fourier transformation, FFT)行各频段脑波power spectral density(PSD)分析.记录后分别行Nissl染色,免疫组化标记早刻基因c-fos与谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)观察VLPO的细胞和GABA能神经元的损毁数量。正常大鼠(n=4)行GAD与组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase,HDC)免疫染色观察TMN的HA能与GABA能神经元在分布和形态上的特点。 结果： 1.双侧损毁VLPO后对睡眠觉醒周期和皮层脑电的影响VLPO损毁后连续记录分析睡眠觉醒周期22天,与before lesion比较,大鼠生理睡眠期(08：00-20：00 h)：觉醒(wakefulness,W)D6-D16曾加,累计平均增加39.59%(P0.01),其中D12达高峰;浅慢波睡眠(light slow wave sleep, SWS1)从D8始增加至D22,平均增加46.86%(P0.01);深慢波睡眠(deep slow wave sleep,SWS2)D4-D22减少,平均减少50.14%(P0.01),明显变化在第二周;异相睡眠(paradoxical sleep, PS)无统计学变化。皮层EEG PSDβ+γ波与a波明显增强,δ波明显减弱,0波变化不明显。生理觉醒期(20：00-08：00 h)：仅第二周的w平均增加15.95%(P0.05)和SWS2减少57.5%(P0.01)。组织学和免疫组化的细胞计数结果微量注射IA导致VLPO内75-90%的GABA神经元/细胞减少,fos与GAD免疫反应阳性细胞数目与SWS2和慢波睡眠(slow wave sleep,SWS)时间呈线性相关。 2.双侧损毁VLPO后注射NPA于TMN对睡眠觉醒周期和皮层脑电的影响VLPO损毁后双侧TMN注射NPA于各时相变化明显的D8,D10,D12和D14,与after lesion plus vehicle组相比,08:00-20:00 h:SWS1和SWS2分别减少23.53%(P0.05)和增加83.41%(P0.01),其中第12天SWS1和SWS2分别减少28.0%(P0.05)和增加158.1%(P0.01);20：00-08：00 h：W减少20.22%(P0.05),SWS1和SWS2分别增加38.38%(P0.05)和113.1%(P0.0