猪α干扰素的原核表达及重组杆状病毒载体的构建

作     者：王建举 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏平安;崔保安

授予年度：2008年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪α干扰素 基因克隆 原核表达 猪肺巨噬细胞 PRRSV 重组杆状病毒 

摘      要：无菌采集健康猪的前腔静脉血,分离培养淋巴细胞,加入ConA诱导培养后,提取总RNA,参照GenBank上猪α干扰素基因序列设计一对引物,应用RT-PCR克隆不含信号肽的猪α干扰素的基因片段,插入pGEM-T Easy载体中,转化JM109感受态细胞,筛选阳性菌株,并进行测序,测序结果用DNAstar软件分析,获得的基因片段大小为498bp,编码166个成熟氨基酸,其核苷酸同源性与GenBank上登陆的猪α干扰素基因均在97.0%以上。 用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGEM-T-pIFNα,回收目的基因片段,插入到原核表达载体pET32a中,构建猪α干扰素原核表达载体pET32a-pIFN-α,转化宿主菌BL21(DE)进行猪α干扰素的表达,SDS-PAGE电泳图谱中出现分子量大小40.2 kD的特异性条带,同预期结果一致。经过优化IPTG的浓度和诱导时间,猪α干扰素的表达量明显提高,表达量约占细菌总蛋白量的20%。应用镍琼脂糖凝胶树脂层析柱吸附纯化猪α干扰素融合蛋白,不同浓度的咪唑缓冲液洗脱吸附蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表明,400mM咪唑的缓冲液洗脱的猪α干扰素蛋白,纯度最高,达到蛋白纯化的预期目的,可以用于抗病毒活性试验。 纯化后的猪α干扰素融合蛋白作用于铺满单层的猪肺巨噬细胞,24h后接种100TCID50猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)。设PRRSV感染的巨噬细胞为阳性对照,正常的巨噬细胞为阴性对照。间接免疫荧光技术检测PRRSV抗原,检测结果显示,阳性对照,出现明显的黄绿色荧光;猪α干扰素作用的巨噬细胞,在PRRSV感染后,无特异荧光;阴性对照,没有出现特异荧光。 将克隆的猪α干扰素连接到供体载体pFastBac Dual中,转化JM109,经过PCR、酶切和基因测序等技术进行筛选,构建了重组供体载体pFastBac Dual-pIFN-α。重组供体载体pFastBac Dual-pIFN-α转化大肠杆菌DH10 Bac,经过卡那霉素、四环素、庆大霉素、X-gal和IPTG的多重筛选和PCR反应鉴定,构建了重组Bacmid杆状病毒载体。