神经管缺陷猴模型的建立及多胎妊娠减胎实验的研究

作     者：黄少勇 

作者单位：昆明理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈永昌

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100211[医学-妇产科学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：神经管缺陷 SHROOM3 VANGL2 WNT5A CRISPR/Cas9 多胎妊娠减胎 

摘      要：神经管缺陷又称神经管畸形(Neural tube defects,NTDs),是一种发病率仅次于先天性心脏病的最常见先天性畸形。这种疾病的发病机制相当复杂,最根本的原因是神经管的不闭合或者不完全闭合。目前这种疾病无法治疗,临床采用的最普遍的方法是通过怀孕前和怀孕早期补充适量的叶酸降低NTDs的发病率,可有效减少70%。为找到更有效的治疗方法,大量的研究集中在对NTDs病人的基因型研究上,发现VANGL2基因参与了神经管闭合过程。小鼠、斑马鱼和非洲爪蟾建立的NTDs的动物模型也进一步证实了Shroom3和Wnt5a基因影响着神经管的发育,然而这些基因在患儿的发育过程中所起的作用并不明确,NTDs病人的基因在发育过程中的作用及机理尚不清楚,而通过胚胎移植来构建NTDs猴模型是最好的研究方法,但胚胎移植会造成不必要的多胎妊娠现象,因此需要减胎以保证小猴的健康出生。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了灵长类动物SHROOM3、VANGL2和WNT5A基因敲除的胚胎,通过突变分析及胚胎发育情况来了解这三个基因在灵长类神经管发育中的作用。除此之外也进行了多胎孕猴经腹氯化钾减胎术以减少多胎现象的发生。研究结果如下:1.基因敲除胚胎的建立和sgRNA的设计及测试针对SHROOM3基因的3号和5号外显子以及VANGL2和WNT5A两个基因的3号外显子设计sgRNA,在细胞水平验证打靶效率,选择工作效率最高的sgRNA开展食蟹猴1-细胞期胚胎的打靶测试。此试验将sgRNA和Cas9 D10A蛋白的混合物注射到受精卵的细胞质中,继续培养胚胎,挑取各个发育阶段的胚胎用于分子检测,部分胚胎用于移植获得怀孕或出生的小猴。2.单独敲除SHROOM3基因的胚胎发育及突变情况通过对食蟹猴受精卵注射SHROOM3基因3号和5号外显子sgRNA和Cas9D10A蛋白,成功构建了50个胚胎。其中11个胚胎用于突变检测,39个胚胎移植到13个受体母猴中。11个被检测的胚胎中有9个实现了基因敲除,移植的胚胎获得了3只出生的小猴,其血液和组织也都发现了SHROOM3基因的突变,但是小猴没有出现NTDs表型。3.同时敲除SHROOM3、VANGL2和WNT5A基因胚胎的突变及发育情况为了深入了解SHROOM3、VANGL2和WNT5A这三个基因在灵长类神经管发育过程中是否存在相互影响,我们对SHROOM3基因3号和5号外显子,VANGL2基因3号外显子和WNT5A基因3号外显子设计sgRNAs,成功构建了22个胚胎,其中8个胚胎开展了移植,14个不同发育阶段的胚胎进行了体外检测。体外检测发现SHROOM3基因敲除的胚胎有6个,VANGL2基因敲除的胚胎有2个,WNT5A基因突变都是阴性。胚胎移植获得了1例怀孕猴但发生了流产,流产组织中存在SHROOM3基因的突变,但没有发现VANGL2和WNT5A基因的突变。4.多胎孕猴经腹氯化钾减胎术10例分析体外受精与胚胎移植技术(IVF-ET)是近年来开展基因编辑及建立灵长类动物模型不可或缺的重要环节。为了提高成功率,胚胎移植往往会将多个胚胎移植到一个受体动物体内,这样可以获得更多的怀孕动物,但也不可避免地出现了较多的多胎妊娠。本实验通过经腹氯化钾减胎术,10例多孕母猴成功减胎6例。上述结果显示,我们在食蟹猴胚胎及出生的小猴中实现了SHROOM3基因的敲除,但出生的小猴并没有表现出NTDs的病理表型。三基因同时敲除的研究中获得了SHROOM3和VANGL2基因同时敲除的胚胎,未得到三个基因同时敲除的胚胎,也没有获得出生的小猴。我们分析认为,SHROOM3基因敲除的小猴没有表型可能是因为出生的小猴是嵌合体,突变的细胞不足以导致明显的NTDs表型;三个基因同时敲除的概率不高。在多胎妊娠减胎实验中,10例多胎孕猴成功减胎6例,6例均保留单胎。本实验为建立灵长类NTDs动物模型及研究基因功能提供了参考实验方案,也为后续解决多基因同时敲除和嵌合体的问题提供了重要参考数据。同时也证明了体外受精-胚胎移植术后多胎妊娠行减胎术是安全有效的,为以后多胎动物减胎提供了坚实的理论依据。