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Loss of shroom3 affects neuroepithelial cell shape through regulating cytoskeleton proteins in cynomolgus monkey organoids

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Zoological Research 2024年第2期45卷 233-241页

作者： Peng Li Ting Zhang Ruo Wu Jun-Yu Zhang Yan Zhuo Shan-Gang Li Jiao-Jian Wang Wen-Ting Guo Zheng-Bo Wang Yong-Chang Chen State Key Laboratory of Primate Biomedical Research Institute of Primate Translational MedicineKunming University of Science and TechnologyKunmingYunnan 650500China Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research KunmingYunnan 650500China

Neural tube defects(NTDs)are severe congenital neurodevelopmental disorders arising from incomplete neural tube closure.Although folate supplementation has been shown to mitigate the incidence of NTDs,some cases,often attributable to genetic factors,remain unpreventable.The shroom3 gene has been implicated in NTD cases that are unresponsive to folate supplementation;at present,however,the underlying mechanism remains unclear.Neural tube morphogenesis is a complex process involving the folding of the planar epithelium of the neural plate.To determine the role of shroom3 in early developmental morphogenesis,we established a neuroepithelial organoid culture system derived from cynomolgus monkeys to closely mimic the in vivo neural plate phase.Loss of shroom3 resulted in shorter neuroepithelial cells and smaller nuclei.These morphological changes were attributed to the insufficient recruitment of cytoskeletal proteins,namely fibrous actin(F-actin),myosin II,and phospho-myosin light chain(PMLC),to the apical side of the neuroepithelial cells.Notably,these defects were not rescued by folate supplementation.RNA sequencing revealed that differentially expressed genes were enriched in biological processes associated with cellular and organ morphogenesis.In summary,we established an authentic in vitro system to study NTDs and identified a novel mechanism for NTDs that are unresponsive to folate supplementation.

关键词： Neural tube defects shroom3 Neuroepithelial Organoids Cynomolgus monkey

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shroom3基因突变导致猴神经管缺陷的分子机制研究

SHROOM3基因突变导致猴神经管缺陷的分子机制研究

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作者：蔡润泽昆明理工大学

学位级别：硕士

神经管(neural tube)是发生中枢神经系统的始基,起源于胚体神经外胚层,在胚胎发育过程中,脊索诱导其背侧中线的神经外胚层形成神经板并发育成神经管。神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)也被称作神经管畸形,在胚胎早期发育时,因神经... 详细信息

神经管(neural tube)是发生中枢神经系统的始基,起源于胚体神经外胚层,在胚胎发育过程中,脊索诱导其背侧中线的神经外胚层形成神经板并发育成神经管。神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)也被称作神经管畸形,在胚胎早期发育时,因神经管不能闭合或闭合不完整导致,是发病概率仅次于先天性心脏病的一种常见先天性畸形。NTDs的起因非常复杂,可能由受环境和遗传因素相互作用引起的。目前,临床上常通过在妊娠前和妊娠早期额外摄入适量叶酸有效降低NTDs发病(约70%)。但是有些NTDs单纯通过补充叶酸并不能有效的预防。当shroom3基因缺失发生神经管闭合不全时,无法单纯通过叶酸补偿来预防和治疗,甚至发现过多的叶酸补偿会导致胚胎的致死性增加。其内在机制由于缺乏合适的动物模型,该基因在人类NTDs发生过程中的作用及机理尚不清楚。非人灵长类与人类大脑在生理结构、发育的空间和时序性上有高度相似性,因此利用非人灵长类模拟人类NTDs,可以在在体外和体内共同探究其发病机制,有望为药物和干细胞移植临床前治疗的有效性和安全性研究提供重要的研究平台。为了探究shroom3基因突变如何影响灵长类神经管缺陷,我们开展了相关实验,主要研究内容和结果如下:1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建shroom3基因敲除食蟹猴胚胎及获得shroom3基因突变的食蟹猴胚胎干细胞(cynomolgus monkey embryonic stem cells,cmESC)。针对食蟹猴shroom3基因的5号外显子设计sgRNA,在胚胎水平验证打靶效率,选择工作效率最高的两个sgRNA和sp Cas9的mRNA共同注射到食蟹猴1-细胞期胚胎,获得shroom3基因突变的胚胎。确定可以获得shroom3基因突变的胚胎后,利用发育到囊胚的胚胎建立ES细胞系获得shroom3基因突变的cmESC。2.shroom3基因在体外神经分化过程中的表达时间窗口建立了体外神经上皮干分化体系,该过程设置了5个时间点来探究shroom3基因在整个发育过程中表达的时间窗口以及表达水平。实验结果表明,在胚胎干细胞时shroom3基因已经表达,且在体外神经分化过程中持续表达,Rosettes结构形成时期shroom3基因表达达到了较高水平。这些数据表明shroom3基因在神经系统发育过程中可能扮演着非常重要的角色,推测神经管闭合与shroom3基因具有重要的关系。3.研究正常及shroom3基因突变cmESC体外神经分化潜能在体外建立神经上皮干细胞分化体系基础上,将ES诱导成神经上皮干细胞(neuroepithelium stem cell,NESC)。通过免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot以及q PCR等技术,在野生型(Wildtype,WT)和shroom3-ESC从胚胎干细胞体外分化过程中取ES,神经花环(Neural Rosettes,NRs),微小类神经管结构(Neural tubes-like,NTs)以及后期NESC分化的细胞这些时间点进行检测,分析正常和突变细胞体外分化能力。发现shroom3促进ES细胞神经定向分化;shroom3基因缺失影响胚胎干细胞向外胚层分化的能力;shroom3基因缺失使神经上皮干细胞向神经元和胶质细胞分化能力增强,但是会使影响大脑可塑性的OTX2表达量降低。没有shroom3的情况下,Wnt信号传导没有受到明显阻断;shroom3基因突变可能会影响细胞生长速率、形态等。结论:shroom3基因在神经发育系统中可能扮演非常重要的角色。在体外,cmESC的shroom3基因突变会影响ESC在体外分化过程中的细胞生长速率、细胞形态,以及向外胚层分化的能力。shroom3基因突变可能会影响到神经分化的潜能,但并不通过直接阻断Wnt信号通路来影响神经管的闭合。shroom3基因突变导致猴神经管缺陷的具体分子机制仍有待进一步研究。

关键词： shroom3 神经管缺陷胚胎干细胞 CRISPR-Cas9

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平面细胞极性通路在神经管缺陷中的作用

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中国比较医学杂志 2019年第7期29卷 102-107页

作者：黄少勇蔡润泽陈永昌昆明理工大学灵长类转化医学研究院昆明650500 云南中科灵长类生物医学重点实验室昆明650500

神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一种常见的神经发育疾病,发病率约为千分之一。该疾病的发病机制较为复杂,是由遗传因素和环境因素共同决定的。研究发现适量补充叶酸能够降低新生儿NTDs的发病率,但尚没有有效的治疗方法。平面... 详细信息

神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一种常见的神经发育疾病,发病率约为千分之一。该疾病的发病机制较为复杂,是由遗传因素和环境因素共同决定的。研究发现适量补充叶酸能够降低新生儿NTDs的发病率,但尚没有有效的治疗方法。平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)信号通路和汇聚延伸(convergent extension,CE)在神经管闭合过程中具有重要作用,一系列遗传因素调控神经管发育,其中shroom3、VANGL2和WNT5A这3个基因在PCP信号通路中不可或缺。本文通过综述shroom3、VANGL2和WNT5A的研究现状,阐述PCP信号通路在神经管闭合过程中发挥的作用,也对遗传性NTDs动物模型的研究进行了回顾。

关键词：神经管缺陷平面细胞极性通路动物模型 shroom3 VANGL2 WNT5A

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神经管缺陷猴模型的建立及多胎妊娠减胎实验的研究

神经管缺陷猴模型的建立及多胎妊娠减胎实验的研究

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作者：黄少勇昆明理工大学

学位级别：硕士

神经管缺陷又称神经管畸形(Neural tube defects,NTDs),是一种发病率仅次于先天性心脏病的最常见先天性畸形。这种疾病的发病机制相当复杂,最根本的原因是神经管的不闭合或者不完全闭合。目前这种疾病无法治疗,临床采用的最普遍的方法... 详细信息

神经管缺陷又称神经管畸形(Neural tube defects,NTDs),是一种发病率仅次于先天性心脏病的最常见先天性畸形。这种疾病的发病机制相当复杂,最根本的原因是神经管的不闭合或者不完全闭合。目前这种疾病无法治疗,临床采用的最普遍的方法是通过怀孕前和怀孕早期补充适量的叶酸降低NTDs的发病率,可有效减少70%。为找到更有效的治疗方法,大量的研究集中在对NTDs病人的基因型研究上,发现VANGL2基因参与了神经管闭合过程。小鼠、斑马鱼和非洲爪蟾建立的NTDs的动物模型也进一步证实了shroom3和Wnt5a基因影响着神经管的发育,然而这些基因在患儿的发育过程中所起的作用并不明确,NTDs病人的基因在发育过程中的作用及机理尚不清楚,而通过胚胎移植来构建NTDs猴模型是最好的研究方法,但胚胎移植会造成不必要的多胎妊娠现象,因此需要减胎以保证小猴的健康出生。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了灵长类动物shroom3、VANGL2和WNT5A基因敲除的胚胎,通过突变分析及胚胎发育情况来了解这三个基因在灵长类神经管发育中的作用。除此之外也进行了多胎孕猴经腹氯化钾减胎术以减少多胎现象的发生。研究结果如下:1.基因敲除胚胎的建立和sgRNA的设计及测试针对shroom3基因的3号和5号外显子以及VANGL2和WNT5A两个基因的3号外显子设计sgRNA,在细胞水平验证打靶效率,选择工作效率最高的sgRNA开展食蟹猴1-细胞期胚胎的打靶测试。此试验将sgRNA和Cas9 D10A蛋白的混合物注射到受精卵的细胞质中,继续培养胚胎,挑取各个发育阶段的胚胎用于分子检测,部分胚胎用于移植获得怀孕或出生的小猴。2.单独敲除shroom3基因的胚胎发育及突变情况通过对食蟹猴受精卵注射shroom3基因3号和5号外显子sgRNA和Cas9D10A蛋白,成功构建了50个胚胎。其中11个胚胎用于突变检测,39个胚胎移植到13个受体母猴中。11个被检测的胚胎中有9个实现了基因敲除,移植的胚胎获得了3只出生的小猴,其血液和组织也都发现了shroom3基因的突变,但是小猴没有出现NTDs表型。3.同时敲除shroom3、VANGL2和WNT5A基因胚胎的突变及发育情况为了深入了解shroom3、VANGL2和WNT5A这三个基因在灵长类神经管发育过程中是否存在相互影响,我们对shroom3基因3号和5号外显子,VANGL2基因3号外显子和WNT5A基因3号外显子设计sgRNAs,成功构建了22个胚胎,其中8个胚胎开展了移植,14个不同发育阶段的胚胎进行了体外检测。体外检测发现shroom3基因敲除的胚胎有6个,VANGL2基因敲除的胚胎有2个,WNT5A基因突变都是阴性。胚胎移植获得了1例怀孕猴但发生了流产,流产组织中存在shroom3基因的突变,但没有发现VANGL2和WNT5A基因的突变。4.多胎孕猴经腹氯化钾减胎术10例分析体外受精与胚胎移植技术(IVF-ET)是近年来开展基因编辑及建立灵长类动物模型不可或缺的重要环节。为了提高成功率,胚胎移植往往会将多个胚胎移植到一个受体动物体内,这样可以获得更多的怀孕动物,但也不可避免地出现了较多的多胎妊娠。本实验通过经腹氯化钾减胎术,10例多孕母猴成功减胎6例。上述结果显示,我们在食蟹猴胚胎及出生的小猴中实现了shroom3基因的敲除,但出生的小猴并没有表现出NTDs的病理表型。三基因同时敲除的研究中获得了shroom3和VANGL2基因同时敲除的胚胎,未得到三个基因同时敲除的胚胎,也没有获得出生的小猴。我们分析认为,shroom3基因敲除的小猴没有表型可能是因为出生的小猴是嵌合体,突变的细胞不足以导致明显的NTDs表型;三个基因同时敲除的概率不高。在多胎妊娠减胎实验中,10例多胎孕猴成功减胎6例,6例均保留单胎。本实验为建立灵长类NTDs动物模型及研究基因功能提供了参考实验方案,也为后续解决多基因同时敲除和嵌合体的问题提供了重要参考数据。同时也证明了体外受精-胚胎移植术后多胎妊娠行减胎术是安全有效的,为以后多胎动物减胎提供了坚实的理论依据。

关键词：神经管缺陷 shroom3 VANGL2 WNT5A CRISPR/Cas9 多胎妊娠减胎

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