叶酸多聚谷氨酸合成酶AtDFC的生物学功能研究

作     者：韩月婷 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张春义

授予年度：2009年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：拟南芥 叶酸代谢 FPGS AtDFC 氮代谢 氨基酸 

摘      要：叶酸是指四氢叶酸及其衍生物这一类物质,是介导一碳单位转移的重要的辅助因子,参与了生物体内许多重要反应。叶酸由三部分构成:蝶啶、对氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸盐。植物和微生物能够自身合成叶酸,二者的合成途径基本相同。植物中叶酸的合成过程涉及两个分支:pABA分支和蝶啶分支,其中pABA分支在质体中进行,蝶啶分支在细胞质中进行,随后这两个分支在线粒体中汇合,形成叶酸分子的主体,在具有谷氨酸加尾功能的酶的作用下,形成四氢叶酸,随后通过其他酶的作用,形成各种不同形式的四氢叶酸衍生物。在拟南芥中,具有谷氨酸加尾功能的酶有4个,分别为AtDFA、AtDFB、AtDFC、AtDFD。AtDFA为二氢叶酸合成酶(dihydrofolate synthase,DHFS),定位于线粒体,在它的催化作用下,一个谷氨酸分子与二氢蝶酸(dihydropteroate , DHP)相结合,形成二氢叶酸;AtDFB、AtDFC、AtDFD为多聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthase,FPGS),分别定位于质体、线粒体和细胞质,在多聚谷氨酸合成酶的作用下,谷氨酸分子可以逐一连接到四氢叶酸的谷氨酸γ位。 多聚谷氨酸形式的叶酸是叶酸依赖型酶所偏好的底物,并且多聚谷氨酸尾可以增加叶酸的稳定性,同时线粒体又是叶酸合成的重要场所,因此探讨线粒体中的多聚谷氨酸合成酶的功能是非常重要的。我们以拟南芥突变体Atdfc为材料,来探讨线粒体中的多聚谷氨酸合成酶AtDFC的生物学功能。 AtDFC在拟南芥生长的各个时期各个组织中普遍表达。Atdfc突变体在营养生长阶段与野生型并无明显差异,但其抽薹的时间要比野生型晚。对其抽薹前后叶数目进行统计,发现其叶数目与野生型相比并无明显变化,这与典型的晚花植物不同。微生物法测定总叶酸含量,Atdfc的总叶酸含量是野生型的64.4%;液相色谱/质谱法对野生型和Atdfc突变体中不同的叶酸衍生物含量进行分析,在突变体中,5-甲基四氢叶酸的含量降低了62.6%,5-甲酰四氢叶酸的含量降低了32.7%。基因芯片的统计结果显示,10.8%的差异基因与代谢途径相关,有4个基因涉及氮代谢,3个基因涉及谷胱甘肽代谢及P450介导的外源物质代谢,另外7个基因都涉及氨基酸的代谢。对野生型和Atdfc突变体中游离氨基酸的含量进行分析,大部分的氨基酸在Atdfc中的含量都有所增加,其中天冬酰胺、精氨酸、谷氨酰胺等参与铵和氨基酸的合成;丝氨酸参与一碳代谢的转移;以分支酸为底物可以合成酪氨酸和苯丙氨酸,这些氨基酸的含量在突变体中均有明显提高。在黑暗诱导叶片凋亡的过程中,在只用水处理的情况下,Atdfc的凋亡速率要比野生型快;用MTX(一种叶酸合成抑制剂)处理时,野生型和Atdfc的凋亡速率都明显加快,而且Atdfc突变体凋亡的速率要比野生型更快一些。对野生型、Atdfc和nia1/nia2(硝酸还原酶双突变体)进行MTX和氮饥饿处理,观察主根长度变化时,发现在正常条件下,野生型与Atdfc的主根长度无明显差异,nia1/nia2的主根长度略短;当用MTX处理时,野生型、Atdfc和nia1/nia2的主根生长都受到明显的抑制,Atdfc和nia1/nia2受到的抑制更明显;氮饥饿处理时,野生型、Atdfc和nia1/nia2的根长也都受到明显的抑制,但Atdfc受到的抑制程度更明显,野生型和nia1/nia2受抑制的程度无明显差别。 以上结果表明,AtDFC对叶酸的合成是非常重要的,线粒体中多聚谷氨酸合成酶(FPGS)功能的缺失导致拟南芥体内叶酸水平的下降,并且会影响氮代谢及氨基酸代谢,引起Atdfc突变体中游离氨基酸水平上升。叶酸合成途径受到阻断后会加速叶片衰老并抑制植物生长,并且在缺乏氮源的情况下,植物生长受抑制程度更加明显。