蛋白质O-GlcNAc糖基化在顺铂抗肿瘤活性中的作用研究

作     者：王迪 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：师以康

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100701[医学-药物化学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：O-GlcNAc 糖基化 OGA OGT CDDP UDP-GlcNAc 肿瘤 

摘      要：O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是指将单个β-N-乙酰葡糖胺连接到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上的一种翻译后修饰。细胞O-GlcNAc 水平受两种关键酶的调节:O-GlcNAc transferase(O-GlcNAc 糖基转移酶,OGT)和 O-GlcNAcase(O-GlcNAc 糖苷酶,OGA),分别参与 GlcNAc的添加和去除。细胞外环境的变化可导致O-GlcNAc的水平迅速改变,当刺激去除后蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平恢复到基线水平。O-GlcNAc稳态的过程对调节许多细胞功能(包括细胞周期进程、应激反应和基因转录等)至关重要。体内O-GlcNAc糖基化平衡的破坏与多种疾病的发生有关,如癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等。在我们的前期研究中使用顺铂(CDDP)、阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)等三种抗肿瘤药物分别作用于肺癌细胞H1299、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7,结果发现肿瘤细胞内的蛋白质O-GlcNAc糖基化水平均显著增高且具有一定的规律性。因此,本论文研究CDDP诱导蛋白质O-GlcNAc糖基化变化的规律及其机制,研究O-GlcNAc糖基化变化对CDDP抗肿瘤活性的影响。由于O-GlcNAc糖基化的程度的改变主要受OGT/OGA和供体UDP-GlcNAc的调节,因此本论文研究了 CDDP对OGT/OGA活性、蛋白表达水平和mRNA水平的变化;研究了 CDDP对供体UDP-GlcNAc以及ATP等能量代谢的影响;研究了 CDDP对O-GlcNAc糖基化的蛋白质表达谱的影响。同时,通过使用抑制剂,在体内外研究了蛋白质的O-GlcNAc的糖基化程度的变化对CDDP抗肿瘤作用的影响。在体外实验中,通过western blotting法检测三种抗肿瘤药物CDDP、ADM和VCR对肿瘤细胞H1299、HepG2和MCF-7糖基化的影响,结果发现,经过药物作用后细胞内的O-GlcNAc糖基化的程度都显著上升且具有浓度上的依赖性。0、2、8和16 μg/mL等不同浓度的CDDP作用于肺癌细胞H1299时,OGA、OGT、PFK1、PKM2、GFAT1等相关蛋白的表达水平没有显著差异。HK2、GRP78和CHOP的表达程度随着CDDP作用浓度的增高显著降低并具有浓度的依赖性。RT-qPCR结果显示,随着CDDP作用浓度的上升OGA、OGT的mRNA的水平显著增长且具有浓度上的依赖性。通过OGA、OGT活性实验检测发现,随着CDDP作用浓度的增加,OGA的活性显著降低且具有浓度依赖性,而OGT的活性没有发生显著的变化。结果表明,OGA活性降低是CDDP诱导O-GlcNAc升高的其中的一个原因。磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法测定CDDP单独及与OGA的抑制剂TMG/PUGNAc联合作用对肺癌细胞H1299增殖的影响,实验结果表明CDDP对H1299有显著的抑制作用且具有浓度上的依赖性;与CDDP单独给药组相比,CDDP与10 μM TMG或100 μM PUGNAc联合给药对肺癌细胞H1299的增殖抑制作用无显著性差异。检测细胞的凋亡结果表明,浓度为0、8、16和64 μg/mL的CDDP单独给药时,细胞凋亡率分别为7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,当CDDP与10 μM TMG联合给药时,细胞的凋亡率分别为9.55%、14.04%、24.65%和44.8%;CDDP与100 μM PUGNAc联合给药时,细胞的凋亡率分别为16.12%、23.68%、30.07%和50.4%;结果表明,相较CDDP给药组,CDDP与TMG或PUGNAc联合给药组没有显著地影响细胞的凋亡。上述结果表明TMG或PUGNAc所诱导的O-GlcNAc的程度的升高不影响CDDP对细胞的增殖抑制,也没改变CDDP诱导的细胞凋亡。SRB法检测CDDP独自及与OGT抑制剂Alloxan联合作用对细胞H1299增殖抑制的影响,实验发现,与CDDP单独给药组相比,CDDP与10 mM Alloxan联合给药对细胞的增殖抑制没有显著变化;细胞凋亡的结果显示,0、8、16和64μg/mLCDDP单独给药H1299细胞时的凋亡率为7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,CDDP与10 mM Alloxan联合给药时细胞的凋亡率分别为19.53%、34.26%、55.02%和74.67%。联合给药的细胞凋亡率明显比CDDP给药组高,结果表明,OGT抑制剂Alloxan降低蛋白质O-GlcNAc的水平后并不影响CDDP对细胞的增殖抑制。在研究CDDP诱导的蛋白质O-GlcNAc糖基化的程度与细胞内UDP-GlcNAc含量的关系时,我们发现在肺癌细胞H1299中,随着