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Glutamine metabolism in Th17/Treg cell fate:applications in Th17 cell-associated diseases

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Science China(Life Sciences) 2021年第2期64卷 221-233页

作者： Guan Yang Yaoyao Xia Wenkai Ren Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Nutrition ControlNational Engineering Research Center for Breeding Swine IndustryCollege of Animal ScienceSouth China Agricultural UniversityGuangzhou 510642China Department of Pathology Microbiology and ImmunologyVanderbilt University School of MedicineNashvilleTN 37232USA

Alteration in the Th17/Treg cell balance is implicated in various autoimmune diseases and these disease-associated *** investigations have shown that glutamine metabolism regulates the differentiation of Th17 and Treg *** we summarize the mechanisms by which glutamine metabolism regulates Th17/Treg cell *** examples of a glutamine metabolism-dependent modulation of the development and progression of several Th17/Treg cell-associated diseases are provided *** review will provide a comprehensive understanding of the importance of glutamine metabolism in the fate of Th17/Treg cell differentiation.

关键词： glutamine Th17 cells Treg cells mTOR udp-glcnac

基于耦合发酵策略的乳酰-N-三糖Ⅱ模块化合成研究

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食品与发酵工业 2024年第15期50卷 16-24页

作者：黎玉李忠霞邓明超王志杰周文 Wengang CHAI 张洪涛糖化学与生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院江苏无锡214122 汤臣倍健营养健康研究院广东广州510000 Glycoscience Laboratory Faculty of Medicine ImperialCollege LondonHarrow HA13UJU.K

母乳寡糖在调节婴儿肠道菌群和保障婴儿健康方面都有积极的作用。乳酰-N-三糖Ⅱ(lacto-N-trioseⅡ,LNTⅡ)是母乳寡糖的核心结构单元。目前合成LNTⅡ的方法存在价格昂贵、操作繁琐等缺点。该研究以乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖为底物用三菌株... 详细信息

母乳寡糖在调节婴儿肠道菌群和保障婴儿健康方面都有积极的作用。乳酰-N-三糖Ⅱ(lacto-N-trioseⅡ,LNTⅡ)是母乳寡糖的核心结构单元。目前合成LNTⅡ的方法存在价格昂贵、操作繁琐等缺点。该研究以乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖为底物用三菌株耦合发酵策略合成LNTⅡ。首先构建用于合成N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(N-acetylglucosamine-1-phosphate,glcnac-1-P)模块的Escherichia coli JM109(DE3)/pET28a-nahK工程菌,优化发酵条件后,glcnac-1-P最高产量为16.88 g/L,转化率为70.05%。然后构建分别包含agx1、agx2、pmglmU基因的3株工程菌,并筛选出*** JM109(DE3)/pET28a-agx1,其合成尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖(uridine diphosphate acetylglucosamine,udp-glcnac)的能力最优,在优化的生产体系中udp-glcnac的最大产量为24.78 g/L。最后构建工程菌*** JM109(DE3)/pET28a-lgtA并与*** JM109(DE3)/pET28a-nahK、*** JM109(DE3)/pET28a-agx1耦合发酵合成LNTⅡ,通过优化三菌株耦合发酵体系,LNTⅡ产量达到3.03 g/L,比优化前提高近4倍。该文基于三菌株耦合发酵策略实现了LNTⅡ的合成,这种策略具有通用性强、简便快捷和成本低廉的优点,将为母乳寡糖的规模化生产提供一种新方法。

关键词： LNTⅡ 耦合发酵母乳寡糖 udp-glcnac glcnac-1-P

蛋白质O-glcnac糖基化在顺铂抗肿瘤活性中的作用研究

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蛋白质O-GlcNAc糖基化在顺铂抗肿瘤活性中的作用研究

作者：王迪山东大学

学位级别：硕士

O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-glcnac)是指将单个β-N-乙酰葡糖胺连接到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上的一种翻译后修饰。细胞O-glcnac 水平受两种关键酶的调节:O-glcnac transferase(O-glcnac 糖基转移酶,OGT)和 O-glcnacase(... 详细信息

O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-glcnac)是指将单个β-N-乙酰葡糖胺连接到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上的一种翻译后修饰。细胞O-glcnac 水平受两种关键酶的调节:O-glcnac transferase(O-glcnac 糖基转移酶,OGT)和 O-glcnacase(O-glcnac 糖苷酶,OGA),分别参与 glcnac的添加和去除。细胞外环境的变化可导致O-glcnac的水平迅速改变,当刺激去除后蛋白质的O-glcnac糖基化水平恢复到基线水平。O-glcnac稳态的过程对调节许多细胞功能(包括细胞周期进程、应激反应和基因转录等)至关重要。体内O-glcnac糖基化平衡的破坏与多种疾病的发生有关,如癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等。在我们的前期研究中使用顺铂(CDDP)、阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)等三种抗肿瘤药物分别作用于肺癌细胞H1299、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7,结果发现肿瘤细胞内的蛋白质O-glcnac糖基化水平均显著增高且具有一定的规律性。因此,本论文研究CDDP诱导蛋白质O-glcnac糖基化变化的规律及其机制,研究O-glcnac糖基化变化对CDDP抗肿瘤活性的影响。由于O-glcnac糖基化的程度的改变主要受OGT/OGA和供体udp-glcnac的调节,因此本论文研究了 CDDP对OGT/OGA活性、蛋白表达水平和mRNA水平的变化;研究了 CDDP对供体udp-glcnac以及ATP等能量代谢的影响;研究了 CDDP对O-glcnac糖基化的蛋白质表达谱的影响。同时,通过使用抑制剂,在体内外研究了蛋白质的O-glcnac的糖基化程度的变化对CDDP抗肿瘤作用的影响。在体外实验中,通过western blotting法检测三种抗肿瘤药物CDDP、ADM和VCR对肿瘤细胞H1299、HepG2和MCF-7糖基化的影响,结果发现,经过药物作用后细胞内的O-glcnac糖基化的程度都显著上升且具有浓度上的依赖性。0、2、8和16 μg/mL等不同浓度的CDDP作用于肺癌细胞H1299时,OGA、OGT、PFK1、PKM2、GFAT1等相关蛋白的表达水平没有显著差异。HK2、GRP78和CHOP的表达程度随着CDDP作用浓度的增高显著降低并具有浓度的依赖性。RT-qPCR结果显示,随着CDDP作用浓度的上升OGA、OGT的mRNA的水平显著增长且具有浓度上的依赖性。通过OGA、OGT活性实验检测发现,随着CDDP作用浓度的增加,OGA的活性显著降低且具有浓度依赖性,而OGT的活性没有发生显著的变化。结果表明,OGA活性降低是CDDP诱导O-glcnac升高的其中的一个原因。磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法测定CDDP单独及与OGA的抑制剂TMG/PUGNAc联合作用对肺癌细胞H1299增殖的影响,实验结果表明CDDP对H1299有显著的抑制作用且具有浓度上的依赖性;与CDDP单独给药组相比,CDDP与10 μM TMG或100 μM PUGNAc联合给药对肺癌细胞H1299的增殖抑制作用无显著性差异。检测细胞的凋亡结果表明,浓度为0、8、16和64 μg/mL的CDDP单独给药时,细胞凋亡率分别为7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,当CDDP与10 μM TMG联合给药时,细胞的凋亡率分别为9.55%、14.04%、24.65%和44.8%;CDDP与100 μM PUGNAc联合给药时,细胞的凋亡率分别为16.12%、23.68%、30.07%和50.4%;结果表明,相较CDDP给药组,CDDP与TMG或PUGNAc联合给药组没有显著地影响细胞的凋亡。上述结果表明TMG或PUGNAc所诱导的O-glcnac的程度的升高不影响CDDP对细胞的增殖抑制,也没改变CDDP诱导的细胞凋亡。SRB法检测CDDP独自及与OGT抑制剂Alloxan联合作用对细胞H1299增殖抑制的影响,实验发现,与CDDP单独给药组相比,CDDP与10 mM Alloxan联合给药对细胞的增殖抑制没有显著变化;细胞凋亡的结果显示,0、8、16和64μg/mLCDDP单独给药H1299细胞时的凋亡率为7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,CDDP与10 mM Alloxan联合给药时细胞的凋亡率分别为19.53%、34.26%、55.02%和74.67%。联合给药的细胞凋亡率明显比CDDP给药组高,结果表明,OGT抑制剂Alloxan降低蛋白质O-glcnac的水平后并不影响CDDP对细胞的增殖抑制。在研究CDDP诱导的蛋白质O-glcnac糖基化的程度与细胞内udp-glcnac含量的关系时,我们发现在肺癌细胞H1299中,随着

关键词： O-glcnac 糖基化 OGA OGT CDDP udp-glcnac 肿瘤

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透明质酸的酶法合成及其应用研究

透明质酸的酶法合成及其应用研究

作者：王帅帅山东大学

学位级别：硕士

糖广泛存在于生物体中,糖不仅是维持生命活动所需能量来源,它们在众多复杂生物过程中也发挥着不可替代的重要作用。透明质酸作为一种独特的糖胺聚糖,在化学结构上由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以重复二糖单位连接而成。不同于其它的... 详细信息

糖广泛存在于生物体中,糖不仅是维持生命活动所需能量来源,它们在众多复杂生物过程中也发挥着不可替代的重要作用。透明质酸作为一种独特的糖胺聚糖,在化学结构上由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以重复二糖单位连接而成。不同于其它的糖胺聚糖,透明质酸没有分支结构,也没有硫酸化修饰。由于其独特的理化性质,透明质酸已经广泛应用在食品、医药、化妆品等领域。近年来,研究表明透明质酸在细胞识别和信号转导方面也发挥着极为重要的作用。例如,肿瘤细胞表面存在大量透明质酸特异性受体,透明质酸与受体结合后,能够通过内吞进入肿瘤细胞,这一发现为透明质酸靶向性抗肿瘤药物的研发奠定了基础。目前,商品化的透明质酸主要通过动物组织提取和微生物发酵两种方式获得。动物组织提取法受动物组织来源、透明质酸含量低等因素限制,同时,其制备工艺复杂、收率较低,容易残存其他种类糖胺聚糖,影响了透明质酸的质量,因此在医药及临床应用领域受到了一定的限制。细菌发酵法生产的透明质酸相比与动物组织提取法具有产率高、污染小等优势,但其也面临着细菌内毒素、蛋白质、核酸和重金属污染的风险。随着分子生物学研究的发展,透明质酸的体内合成途径得到了阐述。透明质酸合酶催化合成透明质酸的过程,需要消耗价格昂贵的糖核苷酸作为底物,限制了酶法合成透明质酸研究的发展。本论文研究旨在偶联糖核苷酸的酶法合成和透明质酸的酶法制备过程,建立单糖起始的透明质酸酶法合成技术体系,并进一步研究寡糖类纳米微球的制备工艺。论文第二章对***来源的glcnac-1-P尿苷转移酶(tGlmU)进行分子改造研究。通过对tGhmU进行同源序列比对和蛋白结构分析,选取tGhmU中的关键保守氨基酸位点进行定点突变,研究这些保守氨基酸位点对催化反应底物选择性和催化活性的影响,以期获得催化活性提高或具有更广泛底物适应性的突变酶。酶学性质检测发现,构建的16个突变酶中,tGlmU Q76E、Q76P具有催化合成非天然糖核苷酸CDP-glcnac的活性,随后利用一锅法双酶法制备获得了稀有糖核苷酸CDP-glcnac;此外,突变酶tGlmU Y103F、N169R的催化合成udp-glcnac的活性有了较大幅度的提高,拓宽了我们对糖核苷酸酶法合成的认识。论文第三章克隆表达了来源于Arabidopsisthaliana的葡萄醛酸激酶(GlcAK),GlcAK能够将GlcA磷酸化成GlcA-1-P,结合课题组已有的GlcA-1-P尿苷转移酶,可以实现udp-GlcA的大量合成。GlcAK在原核表达系统中得到了可溶性表达,实现了 GlcA-1-P的制备,并通过活性炭纯化获得了高纯度的GlcA-1-P。在酶法合成udp-glcnac和udp-GlcA的基础上,论文第四章偶联了糖核苷酸的酶法合成和透明质酸的酶酶法,发展了一个以单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的技术体系,利用单糖作为起始底物,通过对酶反应过程中酶浓度比例、反应顺序等条件的优化,实现了以单糖作为起始底物的透明质酸的酶法合成。该方法避免了价格昂贵的糖核苷酸的消耗,以单糖为原料,建立了经济、高效的透明质酸的酶法合成技术。此外,我们进一步探索了糖类纳米微球的制备技术。利用透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等多糖为原料,基于多糖表面丰富的荷电性,使用离子交联法制备多糖纳米微球,并对制备的纳米微球进行表征。在完善多糖类纳米微球制备工艺的基础上,进一步探索多糖纳米微球在环境治理、消毒灭菌、污水处理等领域的应用。

关键词：透明质酸酶法合成 udp-glcnac udp-GlcA 纳米微球

O-glcnac糖基化调控肿瘤细胞耐药机制研究

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O-GlcNAc糖基化调控肿瘤细胞耐药机制研究

作者：曹禺大连理工大学

学位级别：硕士

化学疗法是临床治疗肿瘤的主要方法之一。然而,几乎所有化疗药使用过程中,肿瘤细胞都会通过不同机制和途径产生耐药,大大限制了患者的治疗效果,使其成为肿瘤治疗的主要障碍。因此,分析肿瘤细胞耐药产生的分子机制,将为肿瘤治疗提供新的... 详细信息

化学疗法是临床治疗肿瘤的主要方法之一。然而,几乎所有化疗药使用过程中,肿瘤细胞都会通过不同机制和途径产生耐药,大大限制了患者的治疗效果,使其成为肿瘤治疗的主要障碍。因此,分析肿瘤细胞耐药产生的分子机制,将为肿瘤治疗提供新的潜在治疗靶点。近年来,越来越多的研究表明,除药泵类转运载体P糖蛋白(P-gp)表达失调导致药物外排增强以外,包括蛋白质糖基化在内的翻译后修饰异常介导的凋亡逃逸也是肿瘤细胞产生耐药的重要机制之一。糖基化修饰异常是肿瘤细胞的共同特征,与肿瘤的生物学行为有着密切关系。研究表明,氧连接的氮乙酰葡糖胺(O-glcnac)糖基化参与了肺癌细胞的顺铂耐药。O-glcnac糖基化是由O-glcnac糖基转移酶(OGT)催化的一种可逆单糖修饰,普遍存在于胞质和核蛋白的丝/苏氨酸残基上,与磷酸化修饰存在竞争关系,参与了众多细胞生理过程和重大疾病的调节。然而,这种重要的糖基化修饰调控肿瘤细胞耐药的作用机制尚待阐明。本论文借助蛋白质免疫印迹、RT-qPCR、液质联用以及流式细胞术等实验手段,分析化疗药敏感和抗性肿瘤细胞中O-glcnac糖基化的改变,阐释O-glcnac糖基化与肿瘤细胞化疗耐药的关系,获得了O-glcnac糖基化调控肿瘤细胞耐药新的分子机制。以阿霉素(DOX)、喜树碱(CPT)等化疗药为例,本文在化疗药内源抗性(Hela、SMMC-7721)和获得性抗性(MCF-7/ADR、HL60/ADR)的肿瘤细胞中发现,相比化疗药敏感(MCF-7、HL60)的细胞系,抗性细胞胞内蛋白整体O-glcnac糖基化水平明显升高,并在DOX刺激后出现动态上调。通过干扰RNA抑制胞内蛋白的O-glcnac修饰水平能够显著降低肿瘤细胞的耐药性。进一步研究表明,肿瘤细胞在DOX刺激后通过转录水平上调氨基己糖生物合成途径(HBP)的关键酶GFAT,继而使得O-glcnac糖基化反应所需的糖供体udp-glcnac积累,增加胞内蛋白的O-glcnac修饰水平。这些结果证明,肿瘤细胞通过上调GFAT表达,增加胞内蛋白的O-glcnac修饰,抑制化疗药诱导的细胞死亡。本文进一步分析了化疗药刺激上调GFAT表达的分子机制。研究发现,DOX可明显上调抗性细胞SMMC-7721、MCF-7/ADR中AKT的磷酸化,继而使得AKT下游的转录因子XBP1被激活。XBP1作为GFAT的转录因子可调控GFAT的转录。下调GFAT的转录水平,降低细胞内udp-glcnac的含量,抑制O-glcnac糖基化,最终导致耐药细胞恢复对DOX的敏感性。此外,本文还证明了药物刺激诱导的蛋白质O-glcnac糖基化增加能够阻断凋亡执行蛋白Caspase-9/3的切割/活化,并增加促生存因子NF-κB和AKT的磷酸化,进而抑制细胞凋亡。既然O-glcnac糖基化能够调控肿瘤细胞化疗耐药,本文进一步在化疗耐药的细胞系使用O-glcnac糖基化抑制剂OSMI-1与化疗药联用。OSMI-1能够在耐药细胞中显著增加化疗药DOX、CPT等诱导的细胞凋亡。在化疗抗性的原代急性粒细胞白血病样本(AML)中也可观察到一致的结果。这些结果从另一角度证明了O-glcnac糖基化在肿瘤细胞耐药中扮演重要角色。综上,本论文的研究结果表明,化疗药物可通过AKT/XBP1通路在转录水平上调HBP途径关键酶GFAT的表达,增加胞内udp-glcnac积累,上调胞内蛋白的O-glcnac糖基化水平,下游凋亡执行蛋白Caspase-9/3被抑制,而促生存因子NF-κB、AKT被激活,因此提高了细胞死亡的阈值,增加了肿瘤细胞的耐药性。通过O-glcnac抑制剂降低胞内糖基化水平可逆转肿瘤细胞的化疗抗性。本文通过对化疗药改变肿瘤细胞内O-glcnac糖基化的研究揭示了一种新的肿瘤细胞耐药机制,为O-glcnac修饰作为新的抗肿瘤靶点提供理论依据和实验证据,为逆转肿瘤化疗耐药提供了新策略。

关键词：化疗耐药氨基己糖生物合成途径(HBP) udp-glcnac O-glcnac糖基化

鲟鱼肽改善HpeG2细胞胰岛素抵抗的分子机制及代谢途径研究

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鲟鱼肽改善HpeG2细胞胰岛素抵抗的分子机制及代谢途径研究

作者：杨蓓江苏大学

学位级别：硕士

鲟鱼肽中的KIWHHTF(K肽)、VHYAGTVDY(V肽)和HLDDALRGQE(H肽),已被报道具有很强的抗炎活性,可通过MAPK通路抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞内炎症反应。炎症对2型糖尿病有诱导作用,然而这三种肽是否具有降糖活性及降糖机制未见报... 详细信息

鲟鱼肽中的KIWHHTF(K肽)、VHYAGTVDY(V肽)和HLDDALRGQE(H肽),已被报道具有很强的抗炎活性,可通过MAPK通路抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞内炎症反应。炎症对2型糖尿病有诱导作用,然而这三种肽是否具有降糖活性及降糖机制未见报道。本研究选用浓度为18 m M的葡萄糖胺诱导HepG2细胞建立体外胰岛素抵抗模型来探究鲟鱼肽的降糖活性及机制,主要结果如下:(1)通过研究三种肽在不同浓度(12.5～200μM)和不同处理时间(24 h和48 h)对胰岛素抵抗HepG2细胞降糖的影响,确定了三种肽可以有效改善胰岛素抵抗的最佳条件为:K肽和H肽在50μM浓度下处理HepG2细胞24 h。处理24 h时,K肽和H肽在12.5～200μM浓度下处理均能显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量,在50μM浓度下葡萄糖消耗量最大,并能显著促进胰岛素抵抗HepG2细胞中的糖原合成;处理48 h时,仅有H肽和K肽,在12.5和50μM浓度下可显著提高HepG2细胞葡萄糖消耗量。(2)通过Western Blot分析,研究了K肽和H肽改善HepG2细胞胰岛素抵抗的潜在机制。结果显示:K肽和H肽通过提高p-IRS、p-PI3K和p-AKT的蛋白表达量来激活PI3K/AKT信号通路,从而调节葡萄糖的吸收;K肽提高了胰岛素抵抗HepG2细胞中GLUT4(葡萄糖转运蛋白)的表达量,加快了细胞内葡萄糖的转运,从而促进细胞内葡萄糖消耗;K肽通过显著降低GS的磷酸化和PEPCK的表达量,促进胰岛素抵抗HepG2细胞内的糖原合成并抑制糖异生,从而调节了细胞内的糖代谢稳态;H肽通过上调GSK-3β磷酸化水平,下调GS磷酸化水平来调控GSK-3β/GS信号通路,促进细胞内糖原合成,改善胰岛素抵抗。(3)基于LC-MS/MS代谢组学技术探究了不同处理组代谢物的差异,初步确定了K肽和H肽处理胰岛素抵抗HepG2细胞后的四种差异代谢物(udp-N-乙酰氨基葡萄糖、D-α-羟基戊二酸、1-甲基腺苷、EPA)及两条发生改变的代谢途径(氨基糖-核苷酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成)。K肽处理后显著变化的三种代谢物为udp-N-乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)、D-α-羟基戊二酸(DGA)、1-甲基腺苷。其中,udp-glcnac为己糖胺生物合成途径的终产物,同时也是O-glcnac糖基转移酶(OGT)的底物,其在组织中的积累可能通过促进特定蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-glcnac修饰来诱导胰岛素抵抗。K肽通过降低HepG2细胞中udp-glcnac含量从而改善胰岛素抵抗。H肽缓解了EPA(二十碳五烯酸)在模型组中的显著降低,表明其改善胰岛素抵抗的机制可能是通过促进HepG2细胞内EPA的生物合成来实现的。四种代谢差异物有成为2型糖尿病生物标志物的潜力。

关键词：生物活性肽胰岛素抵抗代谢组学 udp-glcnac EPA

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O-glcnac修饰研究进展

中国科技论文在线 2007年第8期2卷 543-549页

作者：刘华东陈永湘赵玉芬李艳梅清华大学化学系生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室北京100084

O-glcnac糖基化修饰作为一种特殊的蛋白质翻译后修饰形式,动态调节细胞信号传导途径中很多酶的功能,与磷酸修饰有"阴阳调节"关系,正在成为研究的热点。本文综述了近年来O-glcnac糖基化修饰酶及其供体底物的研究进展。

关键词：化学生物学 O-glcnac修饰 udp-glcnac OGT O-glcnacase