橙色红曲菌（AS3.4384）SOD基因的克隆与功能分析

作     者：涂追 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许杨

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：红曲菌 超氧化物岐化酶(SOD) 基因表达 基因敲除 同源重组 

摘      要：红曲菌是我国重要的微生物资源，能够产生多种具有生物活性的代谢产物，具有很高的商业价值。但是由于红曲菌产桔霉素问题的存在，对红曲的安全性提出了怀疑。实验室前期研究克隆得到了八条可能与桔霉素产毒相关的EST序列。经生物信息学分析，发现其中一个基因P5编码的蛋白与Mn-SOD高度同源。 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子发生歧化反应，具有抗衰老、抗辐射、抗炎等多种生物活性。目前已广泛的应用于医药、食品、化妆品等领域。本研究利用分子生物学技术和方法，初步研究了该基因的功能，主要研究内容如下： 1．通过PCR技术从橙色红曲菌AS3.4384的Fosmid基因组文库中筛选到含有SOD基因的克隆子QE，利用限制性内切酶Sal I将其完全酶切后亚克隆至pUC18质粒Sal I位点，筛选到含有SOD基因及侧翼序列的克隆子pUC18-Q5E4，测序后确定该克隆子为反向插入，含有SOD基因上游907bp及下游356bp序列。 2．成功构建了插入型SOD基因打靶载体pUC18-Q5E4-hph，该载体同源序列长度约为1.8kb。 3．将该基因编码框序列插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，构建重组表达质粒pPIC9K-SOD，经Sal I酶切线性化后，转化至毕赤酵母GS115(HisMut)。将经过PCR鉴定整合目的基因且表型为HisMut的重组菌株进行摇瓶诱导表达。以1％甲醇诱导48h后，重组酵母发酵液上清具有SOD酶活性，初步证实该基因编码SOD。