孔雀石绿在草鱼体内的代谢及残留研究

作     者：李爱心 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李逐波

授予年度：2008年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：孔雀石绿 隐色孔雀石绿 代谢 残留 

摘      要：孔雀石绿(MG)是一种合成的三苯甲烷类工业染料,由于其抗菌效果好,价格便宜,容易获得,曾被广泛地用于水产养殖中。但是由于其具有潜在的致癌作用,已经被许多国家列为禁用药。目前,孔雀石绿被非法用于水产品的养殖和运输过程中的现象仍有存在,因此,加强对该药的检测监管,优化其检测方法,研究其在主要水产品中的代谢规律势在必行。 本研究依据孔雀石绿(MG)和隐色孔雀石绿(LMG)的理化性质,建立了高效液相色谱可见光检测法(HPLC-VIS)和高效液相色谱紫外光检测法(HPLC-UV),前一种方法是加柱后氧化柱,将隐色孔雀石绿氧化为孔雀石绿,利用其洗脱时间不同,从而同时检测两种物质;后一种方法对隐色孔雀石绿的检测非常灵敏,且不用氧化柱,流动相可用甲醇,操作过程简单且节约成本。 在检测草鱼肌肉样品时,用HPLC-VIS检测法,MG和LMG的外标法线性方程分别为:y=150986x-389.38和y=67995x-175.77,相关系数分别为:0.9995和0.9993,线性范围:0.001～0.1mg/kg;用HPLC-UV检测法,MG和LMG的外标法线性方程分别为:y=57138x-3786.4和y=179901x-1199.7,相关系数分别为:0.9927和0.9998,线性范围分别为:0.01～0.1mg/kg和0.001～0.1mg/kg。 在检测草鱼血液样品时,用HPLC-VIS检测法,MG和LMG的外标法线性方程分别为:y=139259x-182.99和y=60093x-149.97,相关系数分别为:0.9991和0.9996,线性范围:0.005～0.5 mg/kg;用HPLC-UV检测法,MG和LMG的外标法线性方程分别为:y=56401x-3825.3和y=181863x-981.91,相关系数分别为:0.9903和0.9985,线性范围分别为:0.05～0.5 mg/kg和0.005～0.5 mg/kg。总之,HPLC—VIS检测法对MG和LMG都有较强的检测灵敏性,HPLC—UV检测法对LMG的检测灵敏度高。 本研究优化了草鱼肌肉和血液样品的前处理方法,采用乙腈提取,二氯甲烷反萃取净化和离心除脂,35℃减压旋蒸浓缩的方法。此方法操作简便,在对肌肉样品和血液样品进行处理后检测,HPLC-VIS检测法中孔雀石绿的相对回收率范围在79.66%～98.341%之间,隐色孔雀石绿的相对回收率范围在75.150%～103.6435%之间;HPLC-UV检测法中孔雀石绿的相对回收率范围在68.1355%～99.6754%之间,隐色孔雀石绿的相对回收率范围在76.1725%～97.0892%之间。符合《兽药残留试验技术规范(试行)》的规定,该方法的回收率在60%～93%之间,符合残留检测的要求。对草鱼肌肉和血液样品的HPLC-VIS和HPLC-UV检测法所测得的日内精密度均小于3,日间精密度均小于8,能够满足检测要求。 本研究先用HPLC-UV检测法研究了肌注孔雀石绿后,草鱼血液中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的代谢规律。发现草鱼在注射孔雀石绿15分钟后,在血液中可同时检测到孔雀石绿和隐色孔雀石绿。孔雀石绿在血液中浓度远远高于注射浓度,表明其在鱼体内吸收、分布、代谢都很迅速,并且可在体内蓄积。在用药15分钟后草鱼血液中隐色孔雀石绿的浓度就达到0.54mg/kg,2小时后其浓度比孔雀石绿高,其消除时间比孔雀石绿长,3天时其在血液中的浓度仍然达到0.51mg/kg。在268nm的检测波长下未见到其他明显的代谢产物,可以初步判定隐色孔雀石绿是孔雀石绿在草鱼体内的主要代谢产物。 模拟生产实践中常用的用药方式:0.3 mg/kg的MG药浴1小时后,检测孔雀石绿在草鱼肌肉和血液中的时间-浓度变化。肌肉组织和血液中MG的峰浓度C分别达到1.80318mg/kg和1.37742mg/kg,远远高于用药浓度,与注射用药结果相同,表明MG在水产品肌肉和血液组织中都有蓄积作用。孔雀石绿在草鱼肌肉和血液中的吸收半衰期T1/2分别为:2.74999小时和1.93770小时,分布半衰期T2/2分别为:0.20468小时和0.17945小时,消除半衰期T3/2分别为:100.38503小时和46.03478小时,表明孔雀石绿具有较强的血管外分布能力,孔雀石绿在草鱼肌肉和血液组织中的吸收分布快,但消除较慢。孔雀石绿在草鱼肌肉和血液中持续了30天,隐色孔雀石绿在草鱼血液和肌肉中分别持续了45天和70天。本研究中草鱼在0.3 mg/kg的MG中药浴1小时后,其肌肉和血液中LMG的浓度分别达到:0.006 mg/kg和0.0053 mg/kg。因此LMG完全可以做为草鱼体内的残留标示物。HPLV-UV检测法可用于草鱼肌肉中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的残留检测。 采用HPLC-UV检测法对