灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对两种呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的抗性风险评估

作     者：张晓柯 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈长军

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：烯肟菌胺 氟吡菌酰胺 灰葡萄孢菌 生物活性 抗性研究 SdhC亚基 氨基酸多态性 

摘      要：由子囊菌亚门的灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病,是一种重要的世界性病害。该病原菌寄主十分广泛,能够侵染200余种植物,包括水果、蔬菜、花卉等植物,可造成重要的经济损失。目前,由于缺少有效的抗病品种,且该病原菌具有产孢量大,繁殖速度快、易产生遗传变异等特点,因此,在生产上灰霉病的防控主要以化学防治为主。烯肟菌胺(SYP-1620)和氟吡菌酰胺(Fluopyram)是两种新型的线粒体呼吸抑制剂。前者是由沈阳化工研究院研发、于2009年在我国完成登记的一种新型、广谱杀菌剂,其作用于菌体线粒体复合物Ⅲ(细胞色素bcl复合体Qo位点)的泛醌,抑制其呼吸作用。然而目前,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌的生物学研究尚未涉及。氟吡菌酰胺是由拜耳研发的,于2012年在我国完成登记,是一种作用于菌体线粒体复合物Ⅱ[琥珀酸脱氢酶(SDH)]的新型杀菌剂,可用于防治70多种作物病害,其中对灰葡萄孢菌、白粉病菌、核盘菌和丛梗孢属引起的病害有特效。然而,氟吡菌酰胺在灰霉病的防治方面研究较少。因此,本文研究了灰葡萄孢菌对两种新型呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的生物学特性,旨在揭示这两种抑制剂与同类药剂之间的差异与相似,从而为灰霉病的防治提供合理的科学指导。本研究主要获得的结果如下:首先,研究了灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线及潜在抗性风险。结果表明:在离体条件下,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌菌丝生长及孢子萌发均表现出很强的抑菌活性,采用菌丝生长速率法建立的108株灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线平均EC50为 0.0130 ±0.0109 μg/mL,孢子萌发法的平均 EC50 为 0.01147 ±0.0062 μg/mL;无论是在草莓还是黄瓜幼苗上,烯肟菌胺均表现出良好的保护与治疗作用,且保护作用优于治疗作用;与敏感菌株相比,烯肟菌胺抗性突变体适合度略有降低;该杀菌剂与同类杀菌剂嘧菌酯有正交互抗性,与其它类型的杀菌剂无交互抗性;所测定的抗药性突变体均在cyt b基因发生单点突变(G143A)。因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对烯肟菌胺具有高水平抗药性风险;烯肟菌胺具有与其他QoIs相类似的毒理学机制。其次,研究了灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险及抗性检测技术。结果表明:100株灰葡萄孢菌菌丝生长平均EC50为1.94 ± 1.55 μg/mL,所建敏感性基线接近正态分布;氟吡菌酰胺的田间抗性菌株适合度显著低于敏感菌株,均在琥珀酸脱氢酶B亚基发生单点突变(H272R);但田间抗性菌株与同类杀菌剂啶酰菌胺及其它类型的杀菌剂之间不存在正交互抗性;因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险属于低至中等水平;利用反向引物3 端加入错配碱基,建立了 ASO-PCR快速检测抗性基因型(H272R)的分子检测技术,该技术能够快速、有效的检测田间特定抗性基因型菌株。最后,研究了灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶C亚基氨基酸多态性与SDHIs药敏性之间的关系。在前面研究中,我们发现部分氟吡菌酰胺抗、感菌株C亚基均发生了变化,且对药剂的敏感性差异很大,我们推测,敏感性的差异可能与SDHIs的靶标SDH有关。为此,本文分析了来自我国不同区域的52株田间灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基的全序列,与测序菌株B05.10相比,发现仅C亚基氨基酸序列存在多态性,共分为5种类型(C0-C4)。这5种类型的菌株对SDHIs药敏性及生物适合度存在显著性差异。通过基因替换技术,构建了无遗传背景差异的5种氨基酸序列多态性的载体,经过PCR验证和Southern杂交验证,获得了相应的突变体(R-CO—R-C4),测定了这5种突变体对啶酰菌胺和氟吡菌醜胺的敏感性,结果表明:R-C0突变体对SDHIs的敏感性明显的高于其余4种多态性突变体。在菌丝生长、产孢量、对碳源利用能力、番茄和草莓叶片上致病力测定中,5种多态性突变体之间存在显著性差异;但在苹果及洋葱上的致病力差异不显著。此外,在一定浓度百草枯作用下,R-C0突变体对百草枯诱导的氧化胁迫的耐受性要低于其余4种多态性突变体。综上所述,烯肟菌胺和氟吡菌酰胺对灰葡萄孢菌均具有很强的抑菌活性,可以用来防治田间的灰霉病,但在实际生产中应注意采用药剂交替使用或混用从而延长杀菌剂的使用寿命。在交互抗性测定中,烯肟菌胺与同类嘧菌酯有正交互抗性,它们之间存在相同的作用机制,而氟吡菌酰胺与啶酰菌胺不存在正交互抗性,作用机制可能存在一定的差异。C亚基多态性与SDHIs类药剂的敏感性有关。