猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用

作     者：程相蕾 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何孔旺;陆承平

授予年度：2007年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：胸膜肺炎放线杆菌 rApxⅣ rApxⅣ-ELISA检测方法 rApxⅣ-IHA检测方法 试剂盒 抗体 

摘      要：1 rApxⅣ-ELISA反应条件的优化和试剂盒的研制 重组ApxⅣ蛋白表达与提纯经过改进，诱导转速由190rpm提高到220rpm：对早期经建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)野毒感染抗体的rApxⅣ-ELISA进行了反应条件的优化，封闭液使用1％BSA在37℃封闭2h。底物溶液中的HO工作浓度从0.025‰降低到0.020‰，显色时间控制在8～10min。在此基础上组装成检测APP抗体的试剂盒可在-20℃保存12个月。该试剂盒的批次内和批次间的变异系数分别为3.2～6.9％和0.1～6.4％，具有特异性、敏感性良好的特点，可快速检测APP的ApxⅣ抗体水平的效果。 2 rApxⅣ-IHA方法的建立 利用大肠杆菌表达的APP的rApxⅣ主要结构蛋白，建立rApxⅣ—IHA检测猪的抗体。致敏绵羊血红细胞的蛋白浓度为15μg／mL，以pH4的TAP缓冲液作为致敏稀释液，37℃水浴1h致敏。IHA采用30μl体系，37℃，作用45min．1∶8孔全凝时判定为阳性，用此方法与本试验室先期建立的rApxⅣ—ELISA方法共同检测血清，328份呈线性正相关，相关系数为0.974。 3 rApxⅣ-IHA试剂盒的研制和实际应用 对建立的检测rApxⅣ抗体的IHA进行进一步的优化，并组装成ApxⅣ-IHA试剂盒，该试剂盒重复试验批间变异系数为0～6.4％;而批内变异系数为0～6.8％，4℃保存可达6个月。实际应用中，该rApxⅣ-IHA试剂盒检测猪血清阳性率32.0％(176／550)，其中人工感染猪血清rApxⅣ—IHA检测阳性率达到92.2％：在检测的猪场中，其中1个6.1％的阳性率;而其余4个猪场阳性率为27.6～45.0％。以上结果表明rApxⅣ—IHA检测方法具有简便、快速和特异性强的特点，适于基层快速定性检测。