地中海实蝇及其近缘种和桔小实蝇复合种基因芯片的研制及应用

作     者：李文芬 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：颜亨梅

授予年度：2008年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：实蝇科 地中海实蝇 桔小实蝇 近缘种 复合种 基因芯片 分类鉴定 

摘      要：检疫性实蝇的鉴定是国际果蔬贸易中最突出的技术问题之一。我国农业部最新颁布的进境植物检疫性有害生物名录将小条实蝇属Ceratitis、果实蝇属Bactrocera列入其中。目前,实蝇的口岸检疫鉴定以传统的形态学鉴定为主,此方法对鉴定者经验依赖性强,受实蝇虫态、饲养周期等的限制。常规分子生物学的方法,如PCR、探针杂交等检测技术只能一次对一种实蝇进行检测,不能满足实际检测的需要。基因芯片技术不但可以弥补上述方法自动化程度低、检测分子数量少和低通量等不足之处,而且能大大提高检测效率。 本研究应用基因芯片技术,建立了地中海实蝇***及其近缘种和桔小实蝇***复合种两种基因芯片,用于地中海实蝇三个近缘种和桔小实蝇五个复合种的鉴定,同时具有小条实蝇属、果实蝇属实蝇初筛的功能。本研究获得了如下主要结果: 1.地中海实蝇及其近缘种和桔小实蝇复合种基因芯片的制备 选择线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COI)为分子标记基因,根据Genbank发表的实蝇科昆虫mtDNA-COI序列,运用DNAstar软件,分析基因序列间的差异性,先后设计合成通用引物2对。在通用引物扩增区间内,设计了检测探针16条,分别是实蝇科通用探针1条,小条实蝇属通用探针1条,果实蝇属通用探针1条,桔小实蝇亚属通用探针1条,地中海实蝇、芒果小条实蝇***和纳塔尔小条实蝇***近缘种探针2条和种特异探针4条,桔小实蝇、木瓜实蝇***、杨桃实蝇***、菲律宾实蝇***、芒果实蝇***等复合种探针6条;设计了质控探针3条,分别是定位点探针、阳性质控探针和阴性质控探针各1条。将探针按照相应阵列点样至醛基化基片,用NANO-PLOTTER 2芯片点样仪分别点样,制备出地中海实蝇及其近缘种芯片和桔小实蝇复合种芯片两种检测芯片。 2.地中海实蝇及其近缘种和桔小实蝇复合种基因芯片杂交条件的优化 芯片杂交条件的优化主要包括芯片杂交体系模板DNA浓度(0.09ng/μL,0.18ng/μL,0.45ng/μL,0.9ng/μL)、杂交时间(1h,2h,6h)、杂交液浓度(0.5×SSPE,2%SDS;1×SSPE,2%SDS;5×SSPE,2%SDS;7.5×SSPE,2%SDS;10×SSPE,2%SDS;3×Blocking)和杂交温度(42℃,44℃,46℃)的优化。筛选出当模板DNA浓度为0.9ng/μL;杂交时间3h;杂交液浓度为:10×SSPE,2%SDS;杂交温度为46℃时,能获得较好的杂交信号。 3.地中海实蝇及其近缘种和桔小实蝇复合种两种基因芯片的初步应用 用制备好的地中海实蝇及其近缘种基因芯片检测了地中海实蝇(不同虫态和地理种)、纳塔尔小条实蝇和芒果小条实蝇;用桔小实蝇复合种基因芯片检测了杨桃实蝇(不同虫态)、桔小实蝇、木瓜实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇,两种芯片的检测结果与常规形态学鉴定结果完全吻合。结果表明两种基因芯片可以作为实蝇快速检测的一种重要手段。