褶纹冠蚌cDNA文库构建与TIMP基因的表达

作     者：陶志英 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：文春根

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 0908[农学-水产] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：褶纹冠蚌 cDNA文库 EST(表达序列标签) TIMP基因 克隆 原核表达 

摘      要：褶纹冠蚌(CristariaPlicata)是中国“淡水育珠蚌之一,由于其易受病原体侵染而经常发病,给其育珠能力产生了较大的影响。因此对其进行分子免疫方面的研究是有必要和实际意义的。 本文用Trizol法提取总RNA,依据SMART试剂盒说明方法合成cDNA,用Sfi Ⅰ酶切,将处理过的PCR产物和pBluescript Ⅱ SK载体相连接,构建褶纹冠蚌血细胞全长cDNA文库。经检测,其滴度为1.07×106cfu/mL,重组率为96%,平均插入片段为732bp。说明所构建的褶纹冠蚌血细胞文库属质量高的全长cDNA,挑500个克隆进行测序,获得297条EST,经分析,已知功能的ESTs为123个,按生物学功能把它们可以分成了七类。 对碱基为821bp的EST片段,进行比对分析后,认为它是褶纹冠蚌TIMP基因,经测定发现它在闭壳肌中表达最大,而在血细胞、外套膜、肝胰腺和性腺中表达量则低得多。注射嗜水气单胞菌6,12,24,48h后,经荧光定量分析测定,其在血细胞,肝胰腺,鳃表达水平均有一定量的升高。 设计含酶切位点的表达引物,从褶纹冠蚌的血液中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-30a(+)-TIMP,转化大肠杆菌BL21,再经过IPTG诱导TIMP表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。最后利用N2+-NTA将其融合蛋白纯化出来。结果表明重组的TIMP在大肠杆菌(Escherichia coli)37℃下诱导均以包涵体形式存在,大小为32KDa左右;其N端表达产物为20KDa左右。优化表达条件后,加1mM IPTG,15℃下诱导34h,其N端表达产物有可溶性蛋白存在,并可以纯化出来。即可通过基因克隆和原核表达的方式可以获得具有生物活性的TMP融合蛋白。