靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治疗策略

作     者：王秦豪 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：药立波;李霞

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胰岛素样生长因子受体 胰岛素受体 PTB结构域 U-box结构域 RING结构域 肿瘤 基因治疗 靶向性泛素化 

摘      要：胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚基构成,两亚基以二硫键连接。其中α亚基负责与胞外配体结合,β亚基含有激酶催化结构域和多个磷酸化位点。当配体结合或因过度表达而导致受体活化时,β亚基胞内多个位点发生磷酸化,从而募集下游含有PTB结构域的胰岛素受体底物1/2(Insulin Receptor Substrate 1/2, IRS-1/2)等接头分子,进而激活下游MAPK和PI-3K等信号通路,促进细胞增殖、转移和侵袭,抑制细胞凋亡,加速肿瘤细胞的恶性转化。胰岛素受体(Insulin Receptor, InsR)作为细胞发生恶性转化的“帮凶,与IGF-1R具有同样的胞内接头分子,介导相同的细胞信号通路,引起类似的细胞效应。因此,IGF-IR和InsR是抗肿瘤治疗的理想靶位。 泛素化介导的蛋白质降解过程,是细胞内蛋白质负向调节的主要方式。泛素化反应过程是在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的协同作用下,使被降解的蛋白发生泛素化,进而在蛋白酶体或溶酶体中降解。其中E3是蛋白质降解的关键连接蛋白,它能够特异性识别与结合底物,并将泛素转移至底物。本研究中利用具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域和Cbl的RING结构域行使降解功能,下调靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,达到抑制肿瘤的目的。 在本研究的第一部分实验中,我们通过重组PCR,将IRS-1蛋白中能够与磷酸化的IGF-IR和InsR结合的PTB结构域(Phosphotyrosine Binding domain)的基因与CHIP的U-box结构域基因或者Cbl的RING结构域基因进行基因融合,将融合基因插入真核表达载体pFLAG-CMV4,构建重组泛素连接酶。在第二部分实验中,我们检测了重组泛素连接酶在几种肿瘤细胞系中的表达和对靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,着重考察了重组泛素连接酶对HeLa细胞的增殖和转移能力的影响。 实验一:设计引物,利用普通PCR分别扩增IRS-1的PTB结构域基因、CHIP的U-box结构域基因和Cbl的RING结构域基因,PTB的下游引物与U-box、RING的上游引物设计了几个连续的反向互补序列,利用重组PCR可将PTB与U-box、PTB与RING进行基因融合,获得的产物分别命名为PTB-U-box和PTB-RING。将融合基因产物进行EcoR I、EcoR V双酶切处理,插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒命名为pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING,以及功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。 实验二:将构建成功的重组泛素连接酶转染几种IGF-IR和InsR高表达的肿瘤细胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC以及HeLa,设立pFLAG-CMV4-PTB- U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空载体pFLAG-CMV4为阴性对照,检测重组泛素连接酶在其中的表达,以及对靶蛋白水平的下调情况,结果显示两种重组泛素连接酶均能促使靶蛋白发生不同程度的下调。同时设计引物,进行Real-time PCR实验,检测重组泛素连接酶的导入,对靶蛋白的mRNA水平是否造成影响,以确定靶蛋白丰度的降低是在翻译后水平产生的。 实验三:随后选取了降解效果最明显的HeLa细胞进行细胞学实验,设立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,pFLAG-CMV4 -PTB、和pFLAG-CMV4为阴性对照,MTT比色实验、平板克隆形成实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力的影响,Transwell实验检测其对细胞转移侵袭能力的影响。结果显示,两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力。 综上所述,在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达,靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成员,参与肿瘤细胞的恶性转化。它们的下调能够抑制肿瘤的发展,所以成为肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,经典的泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径,使被修饰的底物蛋白发生降解。利用能够特异结合IGF-1R和InsR的接头分子的受体结合域实现重组泛素连接酶的靶向性,E3泛素连接酶的催化域实现