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泛素E3连接酶CHIP和E4B互换u-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证

生物技术通报 2021年第12期37卷 191-197页

作者：范宇宸陆瑶刘香男赵博上海交通大学药学院上海200240

旨在构建互换u-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究u-box结构域对两种u-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP u-box替换为E4B u-box的突变体C+E,以及E4B u-box替换为CHIP u-box的... 详细信息

旨在构建互换u-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究u-box结构域对两种u-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP u-box替换为E4B u-box的突变体C+E,以及E4B u-box替换为CHIP u-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换u-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

关键词：泛素E3连接酶CHIP 泛素E3连接酶E4B 突变体 u-box结构域底物

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CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

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军事医学科学院院刊 2005年第4期29卷 316-320页

作者：王生余原野侯春梅于晓妉军事医学科学院基础医学研究所北京100850

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上... 详细信息

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端u-box结构域的突变体H260Q以及u-box结构域缺失体u-box(-)。结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。

关键词：热休克蛋白70羧基端作用蛋白基因表达 TPR结构域 u-box结构域突变卵巢肿瘤

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靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治疗策略

靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治...

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作者：王秦豪第四军医大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚... 详细信息

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚基构成,两亚基以二硫键连接。其中α亚基负责与胞外配体结合,β亚基含有激酶催化结构域和多个磷酸化位点。当配体结合或因过度表达而导致受体活化时,β亚基胞内多个位点发生磷酸化,从而募集下游含有PTB结构域的胰岛素受体底物1/2(Insulin Receptor Substrate 1/2, IRS-1/2)等接头分子,进而激活下游MAPK和PI-3K等信号通路,促进细胞增殖、转移和侵袭,抑制细胞凋亡,加速肿瘤细胞的恶性转化。胰岛素受体(Insulin Receptor, InsR)作为细胞发生恶性转化的“帮凶”,与IGF-1R具有同样的胞内接头分子,介导相同的细胞信号通路,引起类似的细胞效应。因此,IGF-IR和InsR是抗肿瘤治疗的理想靶位。泛素化介导的蛋白质降解过程,是细胞内蛋白质负向调节的主要方式。泛素化反应过程是在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的协同作用下,使被降解的蛋白发生泛素化,进而在蛋白酶体或溶酶体中降解。其中E3是蛋白质降解的关键连接蛋白,它能够特异性识别与结合底物,并将泛素转移至底物。本研究中利用具有泛素连接酶活性的CHIP的u-box结构域和Cbl的RING结构域行使降解功能,下调靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,达到抑制肿瘤的目的。在本研究的第一部分实验中,我们通过重组PCR,将IRS-1蛋白中能够与磷酸化的IGF-IR和InsR结合的PTB结构域(Phosphotyrosine Binding domain)的基因与CHIP的u-box结构域基因或者Cbl的RING结构域基因进行基因融合,将融合基因插入真核表达载体pFLAG-CMV4,构建重组泛素连接酶。在第二部分实验中,我们检测了重组泛素连接酶在几种肿瘤细胞系中的表达和对靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,着重考察了重组泛素连接酶对HeLa细胞的增殖和转移能力的影响。实验一:设计引物,利用普通PCR分别扩增IRS-1的PTB结构域基因、CHIP的u-box结构域基因和Cbl的RING结构域基因,PTB的下游引物与u-box、RING的上游引物设计了几个连续的反向互补序列,利用重组PCR可将PTB与u-box、PTB与RING进行基因融合,获得的产物分别命名为PTB-u-box和PTB-RING。将融合基因产物进行EcoR I、EcoR V双酶切处理,插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒命名为pFLAG-CMV4-PTB-u-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING,以及功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。实验二:将构建成功的重组泛素连接酶转染几种IGF-IR和InsR高表达的肿瘤细胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC以及HeLa,设立pFLAG-CMV4-PTB- u-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空载体pFLAG-CMV4为阴性对照,检测重组泛素连接酶在其中的表达,以及对靶蛋白水平的下调情况,结果显示两种重组泛素连接酶均能促使靶蛋白发生不同程度的下调。同时设计引物,进行Real-time PCR实验,检测重组泛素连接酶的导入,对靶蛋白的mRNA水平是否造成影响,以确定靶蛋白丰度的降低是在翻译后水平产生的。实验三:随后选取了降解效果最明显的HeLa细胞进行细胞学实验,设立pFLAG-CMV4-PTB-u-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,pFLAG-CMV4 -PTB、和pFLAG-CMV4为阴性对照,MTT比色实验、平板克隆形成实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力的影响,Transwell实验检测其对细胞转移侵袭能力的影响。结果显示,两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力。综上所述,在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达,靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成员,参与肿瘤细胞的恶性转化。它们的下调能够抑制肿瘤的发展,所以成为肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,经典的泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径,使被修饰的底物蛋白发生降解。利用能够特异结合IGF-1R和InsR的接头分子的受体结合域实现重组泛素连接酶的靶向性,E3泛素连接酶的催化域实现

关键词：胰岛素样生长因子受体胰岛素受体 PTB结构域 u-box结构域 RING结构域肿瘤基因治疗靶向性泛素化

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大豆PuB基因GmPuB2的克隆与功能分析

大豆PUB基因GmPUB2的克隆与功能分析

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作者：何卓伟南京农业大学

学位级别：硕士

泛素-26S蛋白酶系统（ubiquitin-26S Proteasome System,uPS）是生物界广泛存在的选择性降解蛋白的生命活动方式,并且与植物的细胞周期,抗性反应,信号转导,转录调控,DNA修复,细胞凋亡,分泌途径等过程相关。PuB蛋白（Plant u-box protein... 详细信息

泛素-26S蛋白酶系统（ubiquitin-26S Proteasome System,uPS）是生物界广泛存在的选择性降解蛋白的生命活动方式,并且与植物的细胞周期,抗性反应,信号转导,转录调控,DNA修复,细胞凋亡,分泌途径等过程相关。PuB蛋白（Plant u-box protein, PuB）是泛素-26S蛋白酶系统中一种负责识别底物蛋白的重要组分。目前在大豆中的研究报道较少。本研究在前期工作基础下从大豆品种大白麻中得到一个具有u-box结构域的基因,命名为GmPuB2.通过对GmPuB2基因的克隆测序结果发现该基因全长1885bp,开放阅读框为1320bp,编码439个氨基酸。同源分析结果显示,GmPuB2基因编码的蛋白与菜豆中的Phvu1.008G238500.1蛋白、蒺藜苜蓿中的Medtr5g077510.1蛋白亲缘关系最近,与GmPuB2的氨基酸序列同源性分别达到87.5%和82.0%。从大白麻中克隆到GmPuB2基因起始密码子上游2023bp的启动子片段,通过PLACE数据库的比对分析,发现存在很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要与叶肉特异性表达、干旱、盐害、冷害胁迫应答以及病毒相关。荧光定量PCR分析表明,GmPuB2基因在大白麻的根、荚、子粒中表达量比较高,在叶、花中的表达量次之,茎中的表达量较低。研究发现,GmPuB2基因的表达量受到机械摩擦、盐害、冷害的诱导而上调,但接种大豆胞囊线虫（Soybean cyst nematode, SCN）4号生理小种未导致明显的基因表达量变化。同时GmPuB2基因能被外源激素ABA和SA诱导表达。亚细胞定位结果显示,GmPuB2-GFP融合蛋白定位于细胞核、细胞质和细胞膜上。使用拟南芥蘸花法构建转基因植株,发现转基因拟南芥根系生长更快、对盐胁迫更为敏感、根尖细胞排列紧密以及根型更为粗壮。对转基因拟南芥中的细胞周期进行表达分析发现一些与细胞周期相关的基因AtCYCB1;1、 AtPINl、AtBRL3、AtAGL42表达量提高。由此推测GmPuB2可能通过调控油菜素内酯途径或生长素途径而影响细胞周期,从而导致根尖部分细胞分化加快。长光照下的转基因拟南芥还出现晚抽薹和晚开花的现象,转基因拟南芥中开花抑制因子FLOWERING LOCuS C（FLC）表达量提高,促花基因FLOWERING LOCuS T（FT）、CONSTANS （CO）、LEAFY （LFY）的表达量则降低,推测GmPuB2可能参与光周期和春化途径调控开花时间。

关键词：泛素化 u-box结构域大豆细胞周期开花途径

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