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靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治疗策略

靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治...

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作者：王秦豪第四军医大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚... 详细信息

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚基构成,两亚基以二硫键连接。其中α亚基负责与胞外配体结合,β亚基含有激酶催化结构域和多个磷酸化位点。当配体结合或因过度表达而导致受体活化时,β亚基胞内多个位点发生磷酸化,从而募集下游含有PTB结构域的胰岛素受体底物1/2(Insulin Receptor Substrate 1/2, IRS-1/2)等接头分子,进而激活下游MAPK和PI-3K等信号通路,促进细胞增殖、转移和侵袭,抑制细胞凋亡,加速肿瘤细胞的恶性转化。胰岛素受体(Insulin Receptor, InsR)作为细胞发生恶性转化的“帮凶”,与IGF-1R具有同样的胞内接头分子,介导相同的细胞信号通路,引起类似的细胞效应。因此,IGF-IR和InsR是抗肿瘤治疗的理想靶位。泛素化介导的蛋白质降解过程,是细胞内蛋白质负向调节的主要方式。泛素化反应过程是在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的协同作用下,使被降解的蛋白发生泛素化,进而在蛋白酶体或溶酶体中降解。其中E3是蛋白质降解的关键连接蛋白,它能够特异性识别与结合底物,并将泛素转移至底物。本研究中利用具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域和Cbl的RING结构域行使降解功能,下调靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,达到抑制肿瘤的目的。在本研究的第一部分实验中,我们通过重组PCR,将IRS-1蛋白中能够与磷酸化的IGF-IR和InsR结合的PTB结构域(Phosphotyrosine Binding domain)的基因与CHIP的U-box结构域基因或者Cbl的RING结构域基因进行基因融合,将融合基因插入真核表达载体pFLAG-CMV4,构建重组泛素连接酶。在第二部分实验中,我们检测了重组泛素连接酶在几种肿瘤细胞系中的表达和对靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,着重考察了重组泛素连接酶对HeLa细胞的增殖和转移能力的影响。实验一:设计引物,利用普通PCR分别扩增IRS-1的PTB结构域基因、CHIP的U-box结构域基因和Cbl的RING结构域基因,PTB的下游引物与U-box、RING的上游引物设计了几个连续的反向互补序列,利用重组PCR可将PTB与U-box、PTB与RING进行基因融合,获得的产物分别命名为PTB-U-box和PTB-RING。将融合基因产物进行EcoR I、EcoR V双酶切处理,插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒命名为pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING,以及功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。实验二:将构建成功的重组泛素连接酶转染几种IGF-IR和InsR高表达的肿瘤细胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC以及HeLa,设立pFLAG-CMV4-PTB- U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空载体pFLAG-CMV4为阴性对照,检测重组泛素连接酶在其中的表达,以及对靶蛋白水平的下调情况,结果显示两种重组泛素连接酶均能促使靶蛋白发生不同程度的下调。同时设计引物,进行Real-time PCR实验,检测重组泛素连接酶的导入,对靶蛋白的mRNA水平是否造成影响,以确定靶蛋白丰度的降低是在翻译后水平产生的。实验三:随后选取了降解效果最明显的HeLa细胞进行细胞学实验,设立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,pFLAG-CMV4 -PTB、和pFLAG-CMV4为阴性对照,MTT比色实验、平板克隆形成实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力的影响,Transwell实验检测其对细胞转移侵袭能力的影响。结果显示,两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力。综上所述,在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达,靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成员,参与肿瘤细胞的恶性转化。它们的下调能够抑制肿瘤的发展,所以成为肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,经典的泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径,使被修饰的底物蛋白发生降解。利用能够特异结合IGF-1R和InsR的接头分子的受体结合域实现重组泛素连接酶的靶向性,E3泛素连接酶的催化域实现

关键词：胰岛素样生长因子受体胰岛素受体 PTB结构域 U-box结构域 RING结构域肿瘤基因治疗靶向性泛素化

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嵌合泛素连接酶对慢性粒细胞白血病细胞BCR/ABL的降解及生长抑制作用

嵌合泛素连接酶对慢性粒细胞白血病细胞BCR/ABL的降解及生长抑制...

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作者：李瑗春第四军医大学

学位级别：硕士

慢性粒细胞白血病(CML)是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤，占成年人白血病的20%，其年发病率约为1.6人/10万。CML经历慢性期、加速期、急变期三个阶段，未经治疗患者各阶段的中位数时间分别为4～5年、6～9个月和3～6个月。是一类严... 详细信息

慢性粒细胞白血病(CML)是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤，占成年人白血病的20%，其年发病率约为1.6人/10万。CML经历慢性期、加速期、急变期三个阶段，未经治疗患者各阶段的中位数时间分别为4～5年、6～9个月和3～6个月。是一类严重威胁人类健康的血液系统恶性疾病。90%以上CML患者的血细胞中存在Ph染色体t(9，22)(q34，q11)。由于染色体易位形成了BCR-ABL融合基因，在CML细胞中以p210BCR-ABL最为常见。该融合蛋白不仅失去了c-ABL激酶中N-端Cap结构域对其自身活性的抑制作用，同时BCRN-端的coiled-coil结构域介导BCR-ABL形成同源二聚体或四聚体，进一步导致BCR-ABL的组成性磷酸化及蛋白酪氨酸激酶活性的过度活化。活化的BCR-ABL可通过募集下游分子而激活细胞内的多条信号通路，最终通过各种信号网络的激活而导致细胞过度增殖及凋亡抵抗。多项临床及实验研究均证明，过度活化的BCR-ABL融合基因不仅是CML的特征性标志，而且是CML发生、维持与发展的非常重要的原因。因此，BCR-ABL也是非常好的治疗靶标。泛素-蛋白酶体途径是近三十年来发现的一种细胞内蛋白质高效降解的新机制。此条通路依赖于ATP和泛素，能高度选择性地进行细胞内胞质和核蛋白质的降解，从而调控几乎所有的细胞活动。泛素化反应过程是在ATP参与下，泛素首先与泛素活化酶E1相结合而活化;接着，泛素从E1-泛素复合体被转移到泛素结合酶E2;在泛素连接酶E3的催化下，泛素最后以异肽键连接到靶蛋白。底物蛋白被带上泛素化的标签后，进而在蛋白酶体中被降解。其中E3是蛋白质降解过程中决定底物特异性的重要的酶。RING-E3s由于分子中含有RING催化结构域而得名，为连接酶中最大的家族;U-boxE3s分子结构中含有U-box。这两类E3s均不与泛素形成共价键，而是通过分子中的其他结构域直接或间接与底物结合后，催化泛素分子从E2-泛素复合物传递给底物，促使底物发生泛素化修饰与降解。本研究组通过设计和构建嵌合泛素连接酶，以实现靶向性结合、降解CML中的致癌性Bcr-Abl。在本研究的第一部分实验中，我们采用分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1 （-）构建pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I的真核表达载体，并且转染HEK-293T细胞后证实其能够正确表达，为后续研究奠定了基础。在第二部分实验中，我们检测了嵌合泛素连接酶在K562肿瘤细胞系和HEK-293T细胞系中对靶蛋白的降解作用。第三部分，通过细胞学实验观察嵌合泛素连接酶对K562细胞的增殖抑制和促进凋亡作用。实验一：分别设计引物，通过分段PCR将BCR-ABL分3个片段依次亚克隆入pcDNA3.1（-）。以包含BCR-ABL融合基因全长的pGD210质粒为模板，首先通过PCR分别扩增出Bcr-a片段和Abl-c片段，依次克隆入pcDNA3.1(-)的NheI/XhoI之间和KpnI/HindIII之间，最后XhoI/KpnI双酶切pGD210，将酶切获得的中间片段插入已包含Bcr-a和Abl-c的pcDNA3.1(-)的XhoI/KpnI位点之间，构建为pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl。酶切鉴定及测序正确后，转染293T细胞，Westernblot验证质粒的表达。接着以pcDNA3.1(-)-BCR-ABL为模板，设计定点突变引物，采用重组PCR方法获得315位氨基酸T突变为I(T3151)的片段，置换相应野生型片段，构建pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I突变质粒真核表达载体。实验二：将嵌合泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV-SH2-U或其对照pFLAG-CMV-SH2（来自生化教研室）电击转染入K562细胞，或者将构建成功的pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl/pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I真核表达载体与嵌合泛素连接酶以脂质体共转染入HEK-293T细胞，证实泛素连接酶促进靶蛋白Bcr-Abl降解的作用。研究发现不仅是在内源性高表达靶蛋白的K562中还是在非内源性表达的HEK-293T细胞中，嵌合泛素连接酶都具有下调靶蛋白Bcr-Abl水平的作用。利用Real-timePCR实验进一步证实Bcr-Abl蛋白水平的变化是发生在翻译后水平。实验三：将嵌合泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV-SH2-U或其对照pFLAG-CMV-SH2电击转染K562细胞，采用MTT实验测定细胞的增殖、流式细胞仪测定细胞凋亡。结果证实嵌合泛素连接酶可有效抑制K562肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡综上所述，慢性粒细胞白血病肿瘤细胞中有过度活化的Bcr-Abl融合蛋白，利用成功

关键词：慢性粒细胞白血CML BCR-ABL pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I 分段PCR 靶向性泛素化

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