门诊腹泻患者志贺菌耐药性及基因型研究

作     者：游升荣 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙自镛

授予年度：2006年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：腹泻 志贺菌 耐药 氟喹诺酮 gyrA基因 parC基因 REP-PCR 

摘      要：目的和意义 通过调查武汉市2004年流行季节门诊腹泻患者志贺菌感染状况,分析志贺菌血清型分布及耐药现状,并与2003年做相关比较,研究志贺菌中氟喹诺酮作用靶位点的改变导致氟喹诺酮耐药的机制,并用分子生物学方法对志贺菌进行基因分型,为志贺菌耐药性监测、临床合理用药、新药和疫苗开发及流行病学研究提供理论依据。 方法 收集2004年6月1月武汉市四所大型医院门诊腹泻患者的粪便标本,培养分离志贺菌,进行生化及血清型鉴定。琼脂稀释法测定志贺菌对12种抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration,MIC),纸片扩散法测定志贺菌对另外7种抗菌药物的药物敏感性。结果分析采用WHONET5.3软件和SPSS11.5软件,并与2003年数据比较。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对志贺菌DNA旋转酶gyrA基因和拓扑异构酶IVparC基因扩增、测序,与GenBank数据库中大肠埃希菌的标准序列比对,查找突变点。应用重复基因外回文序列-聚合酶链式反应(repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction,REP-PCR)对志贺菌进行基因分型。 结果 2004年6月1月在武汉市四所大型三级甲等医院门诊患者中共收集粪便标本5079份,分离出志贺菌29株(0.57%),其中B群12株(41%),D群17株(59%)。B群检出三个血清亚型,分别为f1a 2株(16.7%),f2a 4株(33.3%)和f4c 6株(50%)。 志贺菌对19种抗菌药物的耐药性检测结果显示,复方新诺明耐药率最高为100%,萘啶酸、四环素、大观霉素和氨苄西林为72.4%6.6%,氯霉素和阿莫西林+克拉维酸的耐药率为41.4%和31%,庆大霉素、头孢曲松和头孢噻肟为10.3%7.2%,卡那霉素、诺氟沙星和环丙沙星为6.9%.1%,左氧氟沙星、莫西沙星和呋喃妥因均为3.4%,未检出头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南的耐药株。只发现2株志贺菌对氟喹诺酮耐药。 29株志贺菌有20种耐药模式,无全敏感株,少则耐两种,多则耐12种。B群志贺菌以氨苄西林—大观霉素—氯霉素—四环素—复方新诺明—萘啶酸(ASHTRD)六联耐药为主,占50%(6/12);D群志贺菌有2种主要的耐药模式,分别为大观霉素—四环素—复方新诺明—萘啶酸(STRD)四联耐药和氨苄西林—头孢曲松—大观霉素—氯霉素—四环素—复方新诺明—萘啶酸—阿莫西林+克拉维酸—头孢噻肟(AFSHTRDXC)九联耐药,各有2株。 和2003年数据相比,2004年门诊志贺菌分离率升高0.13%,D群比例超过B群。2004年志贺菌对氨曲南耐药率下降16.7%,对复方新诺明耐药率上升20.8%,差异均有显著性。 2株氟喹诺酮耐药志贺菌编号为4194和3222,二者诺氟沙星和环丙沙星的MIC均为16μg/ml和4μg/ml;3222株左氧氟沙星和莫西沙星的的MIC均为8μg/ml,4194株左氧氟沙星和莫西沙星的的MIC均为4μg/ml。靶位基因突变检测发现:4194株和3222株在gyrA基因喹诺酮抗性决定区(quinolone resistance-determing region,QRDR)都存在87位Asp(GAC)→Asn(AAC)点突变,在QRDR外都存在177位Gly(GGT)→Ser(AGT)点突变。除此之外,3222株还有204位Ser(AGC→Ile(AAC)点突变,4194株还有120位Met(ATG)→Leu(CTG)、203位Ile(ATC)→Leu(CTC)、204位Ser(AGC)→Thr(ACC)和205位Ile(ATT)→Leu(CTT)的点突变。两株菌parC基因均未发现点突变。 REP-PCR基因分型结果提示:16株D群志贺菌有A七种指纹图谱。A型分为四个亚型,即A1、A2、A3和A4,除A1有3株外,其余各1株;B型的B1和B2亚型各1株;C型的C1和C2亚型各2株;D、E、F和G型各1株。 12株B群志贺菌有两种指纹图谱,分为H和K型。H型有H1、H2和H3三种亚型,各1株;K型的亚型和株数分别为K12株,K24株,K32株,K41株。 散发分离的菌株有相同或相似的指纹图谱,基因型相同的菌株有不同的耐药表型,相同的耐药表型可对应不同的基因型。 结论 2004年武汉市门诊患者中志贺菌感染率较2003年略有升高,D群菌株数大于B群, B群中f4c比例上升。 2004年门诊分离志贺菌耐药性严重,耐药模式繁多。2003年和2004年志贺菌耐药性除氨曲南耐药率上升和复方新诺明耐药率下降外无显著性变化。临床常用的复方新诺明和氨苄西林耐药率较高,氟喹诺酮耐药率较低。情况紧急需经验