河蟹血细胞中螺原体侵染相关蛋白筛选及Rab7、14-3-3蛋白功能研究
作者单位：南京师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：王文
授予年度：2016年
主 题：中华绒螯蟹 中华绒螯蟹螺原体 iTRAQ 14-3-3 Rab7
摘 要：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,是一种重要的淡水养殖种类,在我国的淡水养殖业中占有很大的比重。目前,在中国江苏省河蟹养殖是一个快速发展的行业,每年的产值在40亿美元左右。然而,随着其养殖规模的不断扩大及集约化程度的提高,一些由细菌、病毒和寄生虫引起的疾病严重阻碍了河蟹养殖业的可持续发展,并造成了巨大的经济损失。中华绒螯蟹颤抖病就是其中最严重的病害之一,而中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是引发该病的一种新型病原微生物。前期的研究证实,该病原主要通过河蟹的鳃或者体表进入到宿主的体内,并首先侵染其靶细胞—血细胞,在血细胞中大量繁殖并伴随着血液循环进而侵染河蟹的神经、肌肉等组织,最终引起河蟹附肢的颤抖并最终导致宿主死亡。河蟹血细胞作为该病原重要的靶细胞,其必定在宿主对该病原的免疫中发挥重要的作用,因此,探究螺原体侵染河蟹血细胞的机制以及河蟹的免疫防御机制,对减少该病原对河蟹养殖业的危害具有重要的意义。本硕士学位论文在目前已有的研究基础上,首先,通过相对定量和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantization iTRAQ)和液相色谱串联质谱(liquid chromatographytandem mass spectrometry LC-MS/MS)技术,筛选中华绒螯蟹螺原体感染10天后河蟹血细胞中差异表达的蛋白,并通过蛋白质组学技术分析该病原可能存在的侵染机制以及宿主对该病原免疫防御机制。其次,通过分析差异表达蛋白,挑选两种蛋白(Rab7和14-3-3)通过基因克隆、蛋白表达、抗体制备等,进一步研究这两种蛋白在病原的侵染和宿主的免疫机制当中发挥的作用。本论文为进一步探究中华绒螯蟹螺原体侵染河蟹的分子机制以及河蟹的免疫机制提供坚实的基础,并为进一步减少螺原体对河蟹养殖业的危害提供理论依据,该论文主要从以下三个方面来开展研究：1. iTRAQ筛选螺原体感染前后中华绒螯蟹血细胞的差异蛋白本实验通过iTRAQ技术筛选螺原体感染前后河蟹血细胞差异表达的蛋白,初步鉴定这些蛋白,根据功能分为免疫相关蛋白、生理相关蛋白以及细胞骨架相关蛋白等等。本实验选择差异倍数≥1.2的蛋白进行功能分析,实验中筛选出来的具有统计学意义的差异蛋白(上调蛋白和下调蛋白)一共有76种。其中上调蛋白有35种,下调蛋白有41种,在这些差异表达的蛋白中大约有20种是与免疫相关的蛋白。上调蛋白包括谷胱甘肽转氨酶(prostaglandin D synthase, GST),铁蛋白(ferritin)和热休克60(heat shock protein 60, HSP60)等。下调蛋白包括两种凝集素蛋白(mannosebinding protein and hemocytin)、三种丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白(two serpins and pacifastin)、三种不同的丝氨酸蛋白酶等等。选择其中的8种蛋白(a2M, GST, ferritin, tubulin, crustin, thioredoxin, clip domain serine protease and serpin),通过实时定量PCR (qRT-PCR)的方法检测其对应蛋白在基因水平的变化,实验结果表明除了tubulin其余的结果都与iTRAQ筛选结果基本保持一致。***7基因克隆、蛋白原核表达及相关功能研究Rab7属于小G蛋白家族中的一种,近期的研究表明Rab蛋白在甲壳类的先天性免疫当中发挥着重要作用。本研究为了进一步验证iTRAQ筛选的Rab7蛋白表达变化以及进一步揭示该蛋白在河蟹的免疫反应当中发挥的作用。本实验首先通过RACE技术扩增了Rab7的基因全长,并成功在体外完成原核表达、纯化以及多克隆抗体的制备。qRT-PCR检测在螺原体的感染下Rab7 mRNA表达变化,通过Western blot技术检测在螺原体的感染下河蟹血细胞当中Rab7蛋白的表达,其结果与iTRQA基本一致。这一结果进一步说明了Rab7在河蟹应对螺原体的感染中发挥重要作用。3.14-3-3基因克隆、蛋白原核表达及相关功能研究14-3-3蛋白是一类酸性可溶性蛋白并且在真核生物中有着广泛的分布,最近的研究表明14-3-3蛋白在甲壳类的先天性免疫过程当中发挥重要作用。本研究为了进一步验证iTRAQ中得到的14-3-3蛋白的表达变化并进一步揭示该蛋白在河蟹的免疫反应当中的作用。首先,通过PCR技术克隆14-3-3的基因,并对序列进行分析。其次,成功在体外完成该蛋白的原核表达,纯化以及多克隆抗体的制备纯化。qRT-PCR技术检测在螺原体的感染下14-3-3mRNA的表达变化,通过Western blot检测该
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