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Acetylproteomics analyses reveal critical features of lysine-ε-acetylation in Arabidopsis and a role of 14-3-3 protein acetylation in alkaline response

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Stress Biology 2022年第1期2卷 685-703页

作者： Jianfei Guo Xiaoqiang Chai Yuchao Mei Jiamu Du Haining Du Huazhong Shi Jian-Kang Zhu Heng Zhang State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics Shanghai Center for Plant Stress BiologyCenter for Excellence in Plant Molecular SciencesChinese Academy of SciencesShanghai 201602China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Hubei Key Laboratory of Cell Homeostasis College of Life SciencesWuhan UniversityWuhan 430072China Department of Biology Institute of Plant and Food ScienceSouthern University of Science and TechnologyShenzhen 518055GuangdongChina Department of Chemistry and Biochemistry Texas Tech UniversityLubbockTXUSA

Lysine-ε-acetylation(Kac)is a post-translational modification(PTM)that is critical for metabolic regulation and cell signaling in ***,its prevalence and importance in plants remain to be *** high-resolution tandem mass spectrometry,we analyzed protein lysine acetylation in five representative Arabidopsis organs with 2~3 biological replicates per organ.A total of 2887 Kac proteins and 5929 Kac sites were *** comprehensive catalog allows us to analyze proteome-wide features of lysine *** found that Kac proteins tend to be more uniformly expressed in different organs,and the acetylation status exhibits little correlation with the gene expression level,indicating that acetylation is unlikely caused by stochastic *** preferentially targets evolutionarily conserved proteins and lysine residues,but only a small percentage of Kac proteins are orthologous between rat and Arabidopsis.A large portion of Kac proteins overlap with proteins modified by other PTMs including ubiquitination,SUMOylation and *** acetylation,ubiquitination and SUMOylation all modify lysine residues,our analyses show that they rarely target the same *** addition,we found that“reader”proteins for acetylation and phosphorylation,i.e.,bromodomain-containing proteins and GRF(General Regulatory Factor)/14-3-3 proteins,are intensively modified by the two PTMs,suggesting that they are main crosstalk nodes between acetylation and phosphorylation *** of GRF6/14-3-3λreveal that the Kac level of GRF6 is decreased under alkaline stress,suggesting that acetylation represses plant alkaline ***,K56ac of GRF6 inhibits its binding to and subsequent activation of the plasma membrane H+-ATPase AHA2,leading to hypersensitivity to alkaline *** results provide valuable resources for protein acetylation studies in plants and reveal that protein acetylation suppresses phosphorylation output by acetylating

关键词： Lysine acetylation Mass spectrometry PTM crosstalk 14-3-3 Alkaline stress

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Molecular Analysis and Expression Patterns of Four 14-3-3 Genes from Brassica napus L.

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Agricultural Sciences in China 2010年第7期9卷 942-950页

作者： ZHAN Gao-miao,TONG Jin,WANG Han-zhong and HUA Wei Key Laboratory for Biological Sciences of Oil Crops,Ministry of Agriculture/Oil Crops Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,P.R.China Key Laboratory for Biological Sciences of Oil Crops Ministry of Agriculture/Oil Crops Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Wuhan 430062 P.R. China

In eukaryotes,14-3-3 proteins constitute a family of ubiquitous regulatory *** play very important roles in many cell ***,their enconding genes and roles in plants remain to be *** this paper,four 14-3-3 genes from Brassica napus *** obtained by randomly sequencing a full-length cDNA library and named as Bn1433-1-4 *** phylogenetic comparison with Arabidopsis 14-3-3 family showed that Bn1433-1 and Bn1433-2 belonged to Episilon group while Bn1433-3 and Bn1433-4 belonged to non-Episilon *** transcript levels of four Bn1433 genes were analyzed in different organs,various stress conditions and some hormone treatments by real-time *** result showed that all the Bn1433s were expressed constitutively in roots,stems,leaves and immature seeds except that Bn1433-4 exhibited strong expression in immature seeds of 14 and 28 DAF（day after flowering）.By the analysis of real-time PCR,different expression patterns of Bn1433s were studied in various stress conditions and hormone *** was suggested that the functions of Bn1433s are diverse and they are involved in the regulation of various stresses and hormones treatments.

关键词： 14-3-3 expression pattem abiotic stress Brassica napus L.

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Targeting 14-3-3 adaptor protein-protein interactions to stimulate central nervous system repair

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Neural Regeneration Research 2017年第7期12卷 1040-1043页

作者： Andrew Kaplan Alyson E.Fournier Department of Neurology and Neurosurgery Montreal Neurological Institute McGill University Montr6al Qu4bec Canada

The goal of developing treatments for central nervous system（CNS）injuries is becoming more attainable with the recent identification of various drugs that can repair damaged *** discoveries have stemmed from screening efforts,large expression datasets and an improved understanding of the cellular and molecular biology underlying axon *** will be important to continue searching for new compounds that can induce axon *** we describe how a family of adaptor proteins called 14-3-3s can be targeted using small molecule drugs to enhance axon outgrowth and regeneration.14-3-3s bind to many functionally diverse client proteins to regulate their *** highlight the recent discovery of the axon-growth promoting activity of fusicoccin-A,a fungus-derived small molecule that stabilizes 14-3-3 interactions with their client *** we discuss how fusicoccin-A could serve as a starting point for the development of drugs to induce CNS repair.

关键词： axon regeneration 14-3-3 gcnl, fusicoccin optic nerve spinal cord injury

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SGK and 14-3-3 protein are involved in the serine/threonine phosphorylation mechanism for TPO/MPL signal transduction

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Chinese Science Bulletin 2001年第22期46卷 1880-1885页

作者： Libing Feng Limin Yang Weiguo Zhou Li Huang Min Wan Shouyuan Zhao Changben Li Fudan Univ Inst Genet State Key Lab Genet Engn Shanghai 200433 Peoples R China

Thrombopioetin (TPO), the critical regulator of platelet production, acts by binding to its cell surface receptor, c-Mpl. Yeast two-hybrid screening was performed to isolate the proteins interacting with the cytoplasmic domain of c-Mpl. 48 positive clones were isolated from 5 xxxxxxxxxx106 independent transformants. The results of sequence analysis demonstrate that they represent 13 different protein encoding sequences. Among them there are a partial coding sequence of serine/threonine protein kinase SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase ) and 14-3-3 theta protein partial coding sequence. GST-pull-down assay and co-im-munoprecipitation in mammal cells have confirmed the interaction between these two proteins and c-Mpl. By constructing a series of deleted c-Mpl cytoplasmic domain, the interaction region in c-Mpl cytoplasmic tail was localized in amino acids 523-554. At the same time, the directed interaction between SGK and 14-3-3 proteins also has been verified by yeast two-hybrid assay. The

关键词： thrombopioetin receptor c-Mpl yeast two-hybrid system SGK 14-3-3 protein interaction.

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柔嫩艾美尔球虫14-3-3基因的原核表达与鉴定

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中国病原生物学杂志 2022年第6期17卷 671-674,681页

作者：程淑琴宫鹏涛张楠李建华王晓岑李新张西臣吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

目的对柔嫩艾美尔球虫(***)14-3-3基因进行克隆表达,对其表达产物进行鉴定及反应原性分析,旨在探索其作为鸡球虫基因工程疫苗候选抗原的可行性。方法以柔嫩艾美尔球虫RNA为模板,通过RT-PCR扩增14-3-3基因,连接至pET-32a(+)载体,构建... 详细信息

目的对柔嫩艾美尔球虫(***)14-3-3基因进行克隆表达,对其表达产物进行鉴定及反应原性分析,旨在探索其作为鸡球虫基因工程疫苗候选抗原的可行性。方法以柔嫩艾美尔球虫RNA为模板,通过RT-PCR扩增14-3-3基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-14-3-3,转化感受态细胞BL21(DE3)后经IPTG诱导表达,利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组质粒pET-32a(+)-14-3-3构建正确。SDS-PAGE检测重组蛋白14-3-3在原核表达系统中主要以可溶性形式表达,融合蛋白的分子质量约为50ku,表达的重组蛋白14-3-3能被相应抗体识别。结论成功构建重组质粒pET-32a(+)-14-3-3,表达的重组蛋白14-3-3具有反应原性,为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。

关键词：柔嫩艾美尔球虫 14-3-3 原核表达蛋白纯化

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Cofilin participates in regulating alpha-epithelial sodium channel by interaction with 14-3-3 isoforms

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The Journal of Biomedical Research 2020年第5期34卷 351-360页

作者： Ashfaq-Ahmad-Shah Bukhari Xue Zhang Min Li Anran Zhao Hao Dong Xiubin Liang Department of Pathophysiology Nanjing Medical UniversityNanjingJiangsu 211166China Department of Pathology Nanjing Medical UniversityNanjingJiangsu 211166China Department of Nephrology the Affiliated Sir Run Run Hospital of Nanjing Medical UniversityNanjingJiangsu 211166China

Renal epithelial sodium channel(ENaC) plays a crucial role in maintaining homeostasis and sodium *** insulin participates in controlling sodium transport across the renal epithelium,the underlying molecular mechanism remain *** this study,we found that insulin increased the expression and function of alphaepithelial sodium channel(α-ENaC) as well as phosphorylation of cofilin,a family of actin-binding proteins which disassembles actin filaments,in mouse cortical collecting duct(mpkCCDc14) *** wild-type(WT)cofilin and its constitutively phosphorylated form(S3 D),but not its constitutively non-phosphorylable form(S3 A),contributed to the elevated expression on α-*** of 14-3-3ε,β,or y increased the expression of α-ENaC and cofilin phosphorylation,which was blunted by knockdown of 14-3-3ε,β,or ***,it was found that insulin increased the interaction between cofilin and 14-3-3 isoforms,which indicated relevance of 14-3-3 isoforms with ***,LIMK1/SSH1 pathway was involved in regulation of cofilin and α-ENaC expression by *** results from this work indicate that cofilin participates in the regulation of α-ENaC by interaction with 14-3-3 isoforms.

关键词： cofilin ENaC insulin 14-3-3 LIMK1 SSH1

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谷氨酰胺经14-3-3蛋白调控炎症反应

谷氨酰胺经14-3-3蛋白调控炎症反应

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作者：胡志凯南昌大学

学位级别：硕士

背景:脓毒症是一种由感染反应失调引发的威胁生命的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),具有高发病率、高病死率的特点。炎症反应失衡作为脓毒症病理生理的机制之一,在其中起到了十分重要的作用。谷氨酰... 详细信息

背景:脓毒症是一种由感染反应失调引发的威胁生命的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),具有高发病率、高病死率的特点。炎症反应失衡作为脓毒症病理生理的机制之一,在其中起到了十分重要的作用。谷氨酰胺是人体中含量最丰富,用途最广的氨基酸。现如今谷氨酰胺已经被广泛研究,发现能维持脓毒症时期器官的形态以及相应的功能,减轻脑、心脏、肝脏、肠道以及肾脏等一系列重要器官。及时有效的补充谷氨酰胺可以减轻炎症反应、抑制炎症因子的释放。14-3-3蛋白家族是一类高度保守细胞蛋白质家族,在所有真核动物中广泛表达。如今的研究也发现14-3-3蛋白与炎症有着紧密的联系,但谷氨酰胺抗炎的作用机制是否与14-3-3蛋白有关还有待研究。方法:细胞实验利用LPS刺激RAW264.7细胞构建细胞炎症模型,通过谷氨酰胺促进14-3-3蛋白的表达。然后通过慢病毒干扰14-3-3 m RNA的表达以减少14-3-3蛋白的表达。RT-q PCR方法检测14-3-3基因的表达水平。WB检测ERK1/2、P-ERK1/2、JNK、P-JNK、p38、P-p38的表达情况,Elisa法检测炎症因子TNF-α以及IL-6的水平。结果:谷氨酰胺会使处于LPS刺激下的RAW264.7细胞过表达14-3-3蛋白谷氨酰胺通过使14-3-3蛋白过表达从而抑制MAPK信号通路抑制炎症反应结论:本研究通过体外实验表明了谷氨酰胺与14-3-3蛋白在MAPK信号通路上调节炎症的机制。研究发现:(1)谷氨酰胺会使处于LPS刺激下的RAW264.7细胞过表达14-3-3蛋白;(2)谷氨酰胺的抗炎作用通过14-3-3蛋白抑制MAPK信号通路来实现。

关键词：谷氨酰胺 14-3-3 炎症 MAPK信号通路

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14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究(英文)

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生物化学与生物物理进展 2011年第12期38卷 1153-1161页

作者：潘伟男李峰毛小环秦旭平邓水秀封芬陈锋李兰芳廖端芳陈临溪南华大学药物药理研究所湖南省高等学校药物蛋白质组学重点实验室湖南省动脉硬化学重点实验室衡阳421001 湖南省食品药品职业学院长沙410001 湖南中医药大学长沙410001 湖南省环境生物职业技术学院衡阳421001

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机... 详细信息

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机制.组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs;Western blotting方法检测14-3-3、pRaf-1、Raf-1、pERK1/2、ERK1/2、cyclinD1、cyclinE的表达;MTT方法观察14-3-3抑制剂Difopein对VSMCs的增殖作用;免疫共沉淀方法检测14-3-3和Raf-1蛋白复合物的形成.Western blotting方法结果显示,apelin-13(0、0.5、1、2、4μmol/L)浓度依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,以2μmol/L最为明显;2μmol/L apelin-13时间依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,在4 h增加最为显著;14-3-3蛋白抑制剂Difopein明显抑制apelin-13诱导的Raf-1磷酸化、ERK1/2磷酸化、cyclinD1及cyclinE表达;免疫共沉淀方法发现apelin-13诱导14-3-3与Raf-1结合增加,而Difopein明显抑制两者结合;MTT法显示Difopein明显抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖.上述结果表明,Apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.

关键词： apelin APJ 14-3-3 血管平滑肌细胞 ERK1/2 Raf-1

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蛋白激酶A介导14-3-3蛋白磷酸化的机制及功能研究

蛋白激酶A介导14-3-3蛋白磷酸化的机制及功能研究

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作者：彭晨太华中科技大学

学位级别：硕士

在哺乳动物中,14-3-3家族蛋白包含(γ、η、β、ζ、σ、ε、θ)7个成员,其蛋白序列高度保守,参与众多细胞生物学过程,例如蛋白质运输、信号转导、物质代谢、凋亡以及细胞周期的调节。14-3-3作为衔接蛋白,通过结合磷酸化的丝氨酸或者苏... 详细信息

在哺乳动物中,14-3-3家族蛋白包含(γ、η、β、ζ、σ、ε、θ)7个成员,其蛋白序列高度保守,参与众多细胞生物学过程,例如蛋白质运输、信号转导、物质代谢、凋亡以及细胞周期的调节。14-3-3作为衔接蛋白,通过结合磷酸化的丝氨酸或者苏氨酸保守基序,与许多蛋白互作,从而影响蛋白的定位,稳定性和活性。现集中于对14-3-3与磷酸化蛋白的互作模式及功能研究,而14-3-3蛋白本身的磷酸化机制及功能并不清楚。正常生理条件下,c AMP依赖的蛋白激酶A(PKA)由催化亚基和调节亚基组成全酶复合物,不具备激酶活性。但当细胞内c AMP升高时,PKA调节亚基与c AMP结合,PKA构象发生改变,这导致PKA的调节亚基与催化亚基解离,PKA发挥激酶功能。14-3-3蛋白具有保守PKA磷酸化基序,本项目证明PKA磷酸化14-3-3家族蛋白中的14-3-3γ、14-3-3β、14-3-3η、14-3-3ζ和14-3-3ε五个成员,并阐明其磷酸化位点。进一步,以PKA诱导14-3-3磷酸化为研究模型,探讨14-3-3的磷酸化对其定位和二聚化的影响。方法:(1)PKA的活性对14-3-3磷酸化的影响(1.1)使用PKA激动剂或者过表达PKA Cα激活PKA,探讨PKA激活对14-3-3蛋白磷酸化的影响(1.2)使用PKA抑制剂或者下调PKA Cα抑制PKA,探讨PKA抑制对14-3-3磷酸化的影响(2)外源表达14-3-3家族蛋白成员,检测PKA激活对外源14-3-3蛋白的影响。(3)14-3-3与PKA蛋白互作(3.1)通过免疫共沉淀的方法检测PKA和14-3-3的互作。(3.2)通过免疫共沉淀的方法检测PKA和14-3-3互作的关键区域。(4)14-3-3为PKA底物(4.1)在体外,使用纯化的14-3-3与PKA蛋白进行体外磷酸化实验。(4.2)在细胞内,通过p-PKA Substrate抗体检测14-3-3是否为PKA的底物。(4.3)突变14-3-3蛋白预测的PKA磷酸化位点,检测PKA对14-3-3突变体磷酸化的影响。(5)14-3-3磷酸化的功能(5.1)免疫荧光检测PKA激活对14-3-3定位的影响。(5.2)使用交联剂检测14-3-3磷酸化对其二聚体形成的影响。结果:***激活促进14-3-3蛋白磷酸化(1.1)在不同细胞系中,PKA的激动剂促进14-3-3磷酸化。(1.2)PKA Cα促进14-3-3磷酸化,但过表达激酶失活型PKA不具有该效应。(1.3)PKA上游GPCR信号的激活促进14-3-3磷酸化。(1.4)PKA的抑制剂或下调PKA Cα抑制14-3-3磷酸化。(1.5)PKA的催化亚基PKA Cα而非PKA Cβ及PKA Cγ促进14-3-3磷酸化。(2)PKA激活促进14-3-3(γ、η、β、ζ)的磷酸化。(3)14-3-3与PKA蛋白互作的研究(3.1)PKA Cα与14-3-3蛋白互作,而PKA调节亚基不能与14-3-3互作。(3.2)PKA与14-3-3的N端(1-80)位氨基酸发生相互作用。(4)14-3-3为PKA的底物(4.1)PKA在体外磷酸化14-3-3。(4.2)PKA促进γ(S59),η(S59),β(S60),ζ(S58)和ε(S59)位点磷酸化。(5)PKA介导的14-3-3磷酸化不影响14-3-3定位和二聚体形成。结论:PKA信号通路激活促进14-3-3家族蛋白(γ、η、、β、ζ和ε)的磷酸化,磷酸化位点分别为其保守的γ(S59)、η(S59)、β(S60)、ζ(S58)和ε(S59)位点;PKA与14-3-3的N端(1-80)位氨基酸互作;PKA介导的14-3-3磷酸化并不影响14-3-3蛋白的定位和二聚体形成。

关键词：磷酸化 GPCR PKA 14-3-3

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脊尾白虾14-3-3基因cDNA全长的克隆和表达分析

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中国水产科学 2016年第1期23卷 44-52页

作者：王有昆刘萍李吉涛李健上海海洋大学水产与生命学院农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开... 详细信息

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。

关键词：脊尾白虾 14-3-3 基因克隆基因表达

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