DHV-Ⅰ单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制

作     者：辛英豪 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜世金

授予年度：2010年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：DHV 原核表达 单克隆抗体 胶体金 免疫层析试纸条 

摘      要：鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV, duck hepatitis virus)引起的主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、致死率高的传染病(Woolcock, P.R. et al. 2003 )。本课题对DHV-Ⅰ病毒结构蛋白VP1进行了原核表达,制备了抗DHV-Ⅰ的单克隆抗体,研制了检测DHV-Ⅰ的胶体金试纸条。 通过RT-PCR方法扩增DHV-ⅠVP1基因片段,并定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,得到的重组质粒转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)PLys中,利用IPTG诱导表达得到大小为47KD的融合蛋白;Western blot分析发现该重组蛋白能与抗DHV-Ⅰ阳性血清进行反应,具有良好的免疫学活性。 用纯化的DHV-Ⅰ病毒作为抗原免疫BALB/C小鼠并建立了间接ELISA筛选方法。经反复试验确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,即纯化的抗原以1:800稀释,4℃包被过夜,以1:4000稀释阴、阳性血清分别作为阴阳性对照,反应条件以37℃90min为最佳,酶标二抗的工作浓度为1:1000稀释。取免疫小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合,以建立的间接ELISA筛选方法对融合的杂交瘤细胞进行检测筛选,经过初检、二检、三检共获得阳性杂交瘤细胞株21株,利用有限稀释法进行了3-4次亚克隆(其中最少有两次为单克隆)后获得5株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1E10、4F8、4E6、5G4、5E11。对这5株杂交瘤细胞株的稳定性、染色体数、亚类、腹水效价、特异性进行了鉴定,结果如下:经连续传代20次和冻存后4个月复苏检测,其分泌抗体的能力差异不显著,稳定性好;染色体数介于100～110之间,具有典型的杂交瘤细胞染色体特征;经亚类鉴定,1E10、4F8、4E6、5G4、5E11杂交瘤分泌的抗体类型分别为IgG2b、IgM、IgG1、IgM、IgG1;单抗腹水效价分别为1:400,1:8000,1:8000,1:32000,1:16000;并具有很好的特异性。 通过硫酸铵沉淀法对腹水单克隆抗体进行纯化并测定了其蛋白含量;在确定标记单克隆抗体最低稳定量后,成功制备了金标单克隆抗体;经反复摸索确定了NC膜最佳包被单克隆抗体的量为1mg/mL,羊抗鼠最佳包被浓度为1:10稀释,同时两者按照1μL/cm喷膜;选择Ahlstrom8964和GRADE7589分别作为金标垫和样品垫制备胶体金试纸条。分别用样品稀释液和病毒液作为阴阳性对照检测试纸条,结果阴性对照只出现质控线而病毒稀释液出现检测线和质控线。临床检测结果表明该胶体金试纸条特异、敏感,可用于DHV-Ⅰ的快速诊断。